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摘要孤儿基因，是指基因组中与谱系进化基因缺乏同源性的一类基因。极端环境微生物孤儿基因组的特异性，是其在极端环境下长期适应进化的结果。耐辐射异常球菌（Deinococcus radiodurans）对多种非生物胁迫有很强的耐受能力，其全基因组测序分析发现该菌株含大量孤儿基因且功能未知。本论文以 D. radiodurans R1 为研究对象，系统分析了孤儿基因的结构特征、在非生物胁迫条件下的表达特性及其调控网络，并具体分析了孤儿基因 dogH 和 dotP 的生物学功能，初步解析了孤儿基因参与 TreS 海藻糖合成路径的调控机制。主要取得如下研究结果：<br>　　1、耐辐射异常球菌孤儿基因组挖掘与分析。比较基因组学及生物信息学分析显示，D. radiodurans 基因组 23.3%（744 个）的基因为孤儿基因，其中 724个为功能未知基因。与非孤儿基因相比，D. radiodurans 孤儿基因具有较短的核苷酸编码区，GC含量偏低1.9%，偏好稀有精氨酸密码子AGA/G，启动子区保守Motif富含G/C碱基。转录组学分析显示，536个孤儿基因能同时响应多种非生物胁迫，形成基于孤儿基因的抵抗逆境胁迫层级调控网络。<br>　　2、耐辐射异常球菌孤儿基因功能鉴定。为解析 D. radiodurans 孤儿基因的极端抗逆功能，本研究结合非生物胁迫条件下转录组和蛋白组数据，选取胁迫诱导表达量较高的17个孤儿基因进行突变分析，并对突变株在各种非生物胁迫条件下进行存活率评价。研究表明，dr0046、dr1455、dr1740 基因参与 D. radiodurans菌株UV 耐受；dr1768、dr1980、dr2412 基因参与 D. radiodurans 菌株渗透和干燥胁迫耐受。其中dr2412编码含GHL10结构域蛋白，命名为DogH（Deinococcus radiodurans orphan Glycosyl hydrolase-like 10）；dr1768 编码含四肽重复序列结构的蛋白，命名为 DotP（Deinococcus radiodurans orphan tetrapeptide repeat sequence）。<br>　　3、孤儿蛋白DogH糖苷水解酶参与TreS海藻糖合成途径。渗透保护剂含量测定表明，D. radiodurans 中海藻糖、麦芽糖含量分别比 E.coli DH5α 高出 28 倍和9倍。研究发现，dogH基因表达可响应渗透胁迫，并受转录调控因子DrRRA的直接调控，dogH 缺失突变株对山梨醇和干燥胁迫敏感。糖类代谢产物测定结果表明，1.0 M 山梨醇胁迫处理 3 h 野生型菌株中麦芽糖、海藻糖含量是突变株ΔdogH的2.6倍、9.2倍。体外水解产物测定显示，DogH可特异性水解可溶性淀粉生成麦芽糖，为TreS酶合成海藻糖提供底物。<br>　　4、DogH受DotP分子伴侣蛋白保护。研究表明，dotP表达受渗透胁迫诱导， dotP缺失突变株对山梨醇和干燥胁迫敏感。体外酶活实验表明，DotP分子伴侣蛋白对TreS途径中DogH糖苷水解酶具有保护作用。在转录因子DrRRA的缺失突变株中，dotP基因表达量下调5.6倍。体外分子互作结果显示，DrRRA与dotP启动子区CTCCCGCGACCGCTC 位点结合，Kd 值为 32.9±12.1 nM，表明 DrRRA可直接调控dotP基因的表达。<br>　　综上所述，本研究分析了D. radiodurans孤儿基因与非生物胁迫的反应关系，解析了孤儿基因dogH和dotP在TreS海藻糖合成路径中的生物学功能，为进一步阐明孤儿基因在微生物胁迫应答调控及适应性进化的机制研究中奠定工作基础。