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摘要目的：由于缺乏早期诊断标志物和有效治疗手段，肺癌作为癌症致死的主要原因已经演变为全球性的公共卫生问题。肺腺癌(Lung adenocarcinoma, LUAD)是肺癌中最常见的亚型，近年来，得益于医疗技术的发展以及创新治疗方式的涌现，尤其是免疫治疗的出现，LUAD患者的5年生存率有所提高，但令人遗憾的是患者的生存率仍然偏低。已有证据表明肿瘤免疫微环境(Tumor immune microenvironment, TIME)在LUAD的生长、侵袭、转移和免疫逃逸等方面发挥着重要作用，并且以免疫细胞为靶点的免疫治疗有助于改善患者的预后。众多研究结果表明，可变剪切(Alternative splicing, AS)与LUAD的发生、发展以及患者预后密切相关。然而，AS是否能成为改变TIME格局的关键因素尚未明确。本研究旨在阐明LUAD TIME与预后相关AS事件之间的联系，并探讨相关预后标志物在 LUAD TIME以及免疫治疗中的作用。<br>　　方法：首先，我们采用SpliceSeq数据库和单因素COX回归分析，筛选与LUAD预后相关的AS事件并构建预后模型，根据风险值将LUAD患者分为高、低风险两组。我们运用 Kaplan-Meier (K-M) 生存曲线分析两组生存时间的差异，采用接收者操作特征(Receiver operating characteristic, ROC)曲线评估风险值预测患者生存的能力，并利用比例风险模型明确风险值是否能作为LUAD的独立预后因素。我们进一步比较了LUAD患者不同临床特征之间风险值的差异，以明确AS预后模型对LUAD发展的影响。为更准确有效地预测LUAD患者生存期，我们通过ROC曲线筛选临床特征并构建Nomogram模型。此外，我们采用 ESTIMATE 分析、单样本基因集富集分析(single-sample gene-set enrichment analysis, ssGSEA)以及 CIBERSORT 方法评估 TIME 特征。为明确AS预后模型在TIME中的意义，我们比较了高、低风险两组间ESTIMATE评分及ssGSEA评分的差异，并采用Pearson相关性检验分析风险值与免疫细胞浸润水平的相关性。为探讨AS预后模型对免疫检查点阻断(Immune checkpoint blockade, ICB)治疗的意义，我们利用Pearson 相关性检验分析风险值与免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitor, ICI)基因之间的相关性，并比较高、低风险组之间ICB相关基因表达水平以及免疫表型评分(Immunophenotype score, IPS)的差异。最后，我们运用TCGA数据库及qRT-PCR检验AS预后模型所涉及的基因，筛选出一个基因并研究其在LUAD发展、TIME、患者预后及 ICB 治疗的作用。我们进一步采用 CCK-8 细胞增殖实验、Transwell 迁移实验以及 Transwell 侵袭实验探究该基因于体外是否能影响LUAD细胞的增殖、迁移以及侵袭能力。<br>　　结果：结果显示，共有43948个AS事件纳入本研究，与LUAD预后相关的AS事件有2319个。我们构建了一个包含12个AS事件的AS预后模型，包括BEST3|23330|AT, CDKN2A|86004|AP, TTC39C|44852|AP, MEGF6|315|ES, PKIB|77377|AP, CA5B|98313|ES, HNRNPLL|53258|AT, LDB1|12935|AP, C12orf76|24406|AT, AP2B1|40327|AD, LETM2|83399|AT, MKL1|62348|AP，共涉及12个相关基因。K-M生存曲线结果表明，高风险组的患者生存期较短(p＜0.001)；ROC曲线结果显示，风险值于1， 3，5 年的线下面积(Area under curve, AUC)均大于0.7，提示风险值具有较强的预测患者生存的能力；比例风险模型结果显示，风险值可以作为LUAD的独立预后因子(p＜0.001)。以上结果提示我们构建AS预后模型成功。不同临床特征LUAD患者风险值的差异分析结果显示，患者的分期越晚，风险值越高。临床特征及风险值的ROC曲线结果显示仅有临床病理分期和风险值的AUC值大于0.6，因此我们构建了一个包含临床病理分期和风险值的 Nomogram 模型，其矫正曲线提示该模型能有效预测LUAD患者生存期。此外，ESTIMATE评分差异分析结果显示，与低风险组相比，高风险组患者的免疫评分与基质评分更低(p＜0.001)；ssGSEA评分差异分析结果显示，高、低风险组之间多种免疫功能富集存在差异(p＜0.05)；Pearson检验分析风险值与CIBERSORT分析结果显示，风险值与10种免疫细胞浸润水平存在相关性(p＜0.05)。以上结果提示，AS预后模型与TIME之间存在密切联系。我们进一步查询相关文献并运用TCGA数据库筛选出6个ICI基因以及47个ICB相关基因，并通过癌症免疫组图谱(The Cancer Immunome Atlas, TCIA)获取IPS数据以明确LUAD患者对ICI治疗的反应。风险值与6个ICI基因的 Pearson 相关性检验结果显示，风险值与 CTLA4（r=-0.16， p=0.00044）和 HAVCR2（r=-0.16，p=0.00037）的表达水平呈负相关；高、低风险组之间47个ICB相关基因差异分析结果显示，30个ICB相关基因具有差异(p＜0.05)；IPS差异分析结果提示，低风险组的LUAD患者对ICI免疫治疗反应更佳。以上结果提示，AS预后模型对ICB治疗具有重要意义。在AS预后模型所涉及的12 个基因中， TCGA数据库和qRT-PCR分析结果显示，TTC39C, CA5B, CDKN2A, PKIB, MEGF6, LDB1, BEST3, AP2B1 以及C12orf76 存在差异(p＜0.05)。其中，PKIB在LUAD组织以及细胞中上调倍数最高，且高表达的PKIB预示着更差的预后。同时，PKIB与ICI基因、ICB相关基因以及TIME存在密切联系，结果提示PKIB在ICB治疗和TIME的改变具有重要的意义，且PKIB 可能是 LUAD 中一个潜在有价值的治疗靶点。CCK-8 细胞增殖实验、Transwell迁移实验以及Transwell侵袭实验结果提示，敲低PKIB可有效抑制LUAD细胞的增殖、迁移以及侵袭。<br>　　结论：本研究通过构建AS预后模型，并依据风险值将病人精准分类，且明确了高、低风险组患者之间的TIME特征以及对ICB治疗反应存在差异，为LUAD患者的个体化治疗以及精准治疗提供了重要参考。PKIB在LUAD组织及细胞中高表达，与患者预后密切相关。敲低PKIB可有效抑制LUAD细胞的增殖、迁移以及侵袭，且PKIB可能是一个潜在有价值的免疫治疗靶点。