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摘要研究背景及目的：胎盘是胎儿从母体内获取必需营养及氧气的器官。胎盘组织的大部分组成由滋养层细胞发育而来。滋养层细胞系的正常发育和功能的有序进行是保障良好妊娠结局的基础。胎盘功能异常会直接影响妊娠结局及后代健康。琥珀酸是三羧酸循环的中间产物，主要参与细胞能量代谢。琥珀酸的主要代谢酶为琥珀酸脱氢酶，能够催化琥珀酸生成富马酸，并负责有氧呼吸链电子传递。已有实验表明，复发性流产患者母胎界面存在琥珀酸和SDHB代谢异常现象，且与滋养层细胞中琥珀酸相关作用通路的异常有关。然而目前琥珀酸和SDHB对人滋养层细胞命运调控的研究相对不足。本课题研究旨在探讨琥珀酸和SDHB参与滋养层细胞系功能和发育的相关机制和在复发性流产中的潜在作用。<br>　　研究方法：本课题收集了复发性流产患者清宫术后和正常健康对照人工流产的早孕绒毛组织，对绒毛中SDHB的蛋白、mRNA的表达情况进行了蛋白免疫印迹(Western blot)、实时荧光定量PCR (qPCR)、组织免疫荧光(Immunofluorescence, IF)等实验分析。课题从人早孕绒毛来源分离和培养了滋养层干细胞（trophoblast stem cells，TSCs）。实验设计应用琥珀酸二甲酯和丙二酸二甲酯处理人TSCs, 分别提高和降低细胞琥珀酸盐水平，同时利用试剂盒检测细胞琥珀酸及琥珀酸脱氢酶水平，以探究人TSCs功能和发育发生的相应改变。实验构建了SDHB过表达和敲低稳定细胞株，进一步验证琥珀酸脱氢酶通过影响细胞琥珀酸盐水平调控人TSCs细胞命运。课题主要应用qPCR和Western blot实验测定细胞干性和分化相关标识物以及组蛋白甲基化水平。<br>　　研究结果：与正常对照组绒毛组织相比，RSA患者胎盘绒毛组织中SDHB蛋白和mRNA表达显著增加。组织免疫荧光定位表明SDHB在7-8周的早期绒毛和39-40周的产期绒毛均表达。在早期绒毛中，在绒毛滋养层细胞、合胞体滋养层细胞和绒毛膜外滋养层细胞均表达。在早孕期绒毛中细胞滋养层的SDHB表达较合胞体滋养层（P＜0.0001）和绒毛外滋养层（P＜0.01）更为显著。琥珀酸二甲酯（1mM）处理细胞明显提高细胞琥珀酸盐水平。细胞内琥珀酸的增加促使人滋养层干细胞分化相关基因表达增加。丙二酸二甲酯（1mM）通过抑制细胞有氧呼吸从而降低细胞琥珀酸盐水平则有利于人滋养层干细胞干性维持相关基因表达，使其维持幼稚状态。通过对机制进一步研究，细胞琥珀酸水平升高会提高组蛋白甲基化H3K4me3水平，与之相反琥珀酸盐水平降低则提高H3K27me3水平。因此，细胞琥珀酸盐水平的变化可能通过调节H3K4me3和H3K27me3的共价修饰进而触发人滋养层细胞系发育过程中的表观遗传机制。结合课题组人TSCs组蛋白甲基化数据库挖掘，实验验证内皮 PAS 结构域包含蛋白-1(Endothelial PAS domain-containing protein 1, EPAS1)是琥珀酸诱导人滋养干细胞分化的关键因子。同时，针对琥珀酸旁分泌功能，本课题验证琥珀酸/G蛋白偶联受体91（G-Protein Coupled Receptor 91，GPR91）轴对滋养层细胞功能的调控。琥珀酸盐介导的GPR91信号传导可以通过稳定缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-2alpha, HIF-1α)来调节白细胞介素-1β（Interleukin-1β，IL-1β）和趋化因子受体4（chemokine receptor 4， CXCR4）表达。<br>　　研究结论：琥珀酸脱氢酶表达水平的高低能够改变细胞滋养层细胞琥珀酸盐含量。在细胞内，它影响H3K4me3和H3K27me3的水平，并在滋养层细胞命运的变化中发挥作用。细胞琥珀酸水平升高会促进H3K4me3，从而增加EPAS1的表达，进一步诱导人滋养层干细胞分化。相反，较低水平的琥珀酸会促进H3K27me3，阻碍EPAS1的表达，从而维持人滋养层干细胞的幼稚状态。在细胞外，琥珀酸作为一种信号分子，通过琥珀酸/GPR91轴调节滋养层细胞核蛋白HIF-1α表达从而影响免疫相关趋化因子（如IL-1β和CXCR4）分泌水平，进而参与RSA的发生发展。