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摘要目的：<br>　　本课题研究髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）在胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis, CIA）小鼠疾病进展过程中的动态变化，探讨METTL3介导的m6A甲基化修饰在MDSCs功能及分化中的作用。<br>　　方法：<br>　　（1）检测CIA进展过程中MDSCs及其亚群比例及功能的动态变化<br>　　利用Ⅱ型牛胶原与弗氏完全佐剂研磨成油包水状乳剂，注射至DBA/J小鼠尾根部构建CIA小鼠模型。对CIA小鼠进行临床评分并通过酶联免疫吸附实验（ELISA）检测CIA小鼠外周血清抗CⅡ-IgG水平来鉴定CIA小鼠模型是否构建成功。流式细胞术（FCM）检测CIA小鼠脾脏MDSCs及其亚群（PMN-MDSCs及M-MDSCs）比例的变化。首次免疫第28天、35天、42天后，处死小鼠，利用免疫磁珠分选CIA小鼠脾脏MDSCs亚群（以下分别简写为d28-PMN-MDSCs、d28-M-MDSCs、d35-PMN-MDSCs、d35-M-MDSCs、d42-PMN-MDSCs、d42-M-MDSCs），FCM鉴定细胞纯度和细胞活性。免疫磁珠分选正常小鼠CD4+ T细胞，经CFSE染料标记后与MDSCs亚群共培养96 h，FCM检测CD4+ T细胞的增殖情况，ELISA检测CD4+ T细胞体外增殖体系中IFN-γ的水平。将d28-PMN-MDSCs、d28-M-MDSCs分别过继转移到CIA小鼠体内，观察其对CIA小鼠疾病进展的影响。<br>　　（2）检测CIA小鼠MDSCs及其亚群中METTL3的变化和功能<br>　　免疫磁珠分选CIA小鼠脾脏中的MDSCs亚群，斑点印迹（dot blotting）检测CIA小鼠MDSC亚群甲基化水平随疾病进展的动态变化。蛋白免疫印迹（Western Blot, WB）检测MDSCs亚群中m6A相关酶的表达随疾病进展的动态变化。利用METTL3特异性小干扰（siRNA）敲低MDSCs亚群中METTL3的表达，或使用METTL3抑制剂（STM2457）抑制MDSCs亚群中METTL3的活性后，将MDSCs亚群与CD4+ T细胞共培养，FCM检测CD4+ T细胞的增殖情况。在构建CIA小鼠模型的过程中，使用STM2457进行干预处理，观察STM2457对CIA小鼠疾病进展的影响。<br>　　结果：<br>　　（1）与佐剂对照相比，CIA组小鼠足趾明显红肿，临床评分及血清抗CⅡ-IgG水平显著升高，表明成功构建CIA小鼠模型。FCM检测小鼠脾脏MDSCs的比例和数量，结果显示，d28-MDSCs比例为7.973%±0.139%，数量为（10.793±0.194）×106；d35-MDSCs比例为6.757%±0.265%，数量为（7.580±0.288）×106；d42-MDSCs比例为5.943%±0.129%，数量为（5.790±0.360）×106。与对照组相比，d28-CIA小鼠脾脏中MDSCs的比例和数量明显升高（p＜0.001）；随着CIA小鼠疾病的进展，MDSCs的比例和数量逐渐下降（p＜0.05）。进一步分析MDSCs亚群的比例及数量，结果显示， d28-PMN-MDSCs、d35-PMN-MDSCs、d42-PMN-MDSCs占MDSCs的比例分别为64.600%±1.000%、57.200%±1.100%和53.600%±1.300%，数 量 分 别 为（ 6.367±0.313 ） ×106、（ 4.731±0.106 ） ×106 和（4.208±0.123）×106；d28-M-MDSCs、d35-M-MDSCs、d42-M-MDSCs占MDSCs的比例分别为28.733%±2.706%、34.650%±1.850%和29.933%±2.791%，数量分别为（3.807±0.161） ×106、（3.857±0.035）×106和（3.558±0.230）×106。与对照组相比，d28-PMN-MDSCs的比例和数量显著升高（p＜0.001），且随着CIA疾病的进展，PMN-MDSCs比例及数量降低（p＜0.05），而M-MDSCs的比例和数量在CIA进程中则没有显著变化。FCM分析显示，在CD4+ T细胞体外增殖体系中，与d28-PMN-MDSCs共培养的CD4+ T细胞的增殖被明显抑制，d28-M-MDSCs对CD4+ T细胞的抑制作用较d28-PMN-MDSCs弱。随着CIA疾病进展， PMN-MDSCs和M-MDSCs的免疫抑制功能均减弱。在CD4+ T细胞分别与d28-PMN-MDSCs、d35-PMN-MDSCs、d42-PMN-MDSCs共培养的增殖体系中，IFN-γ的水平逐渐增高（p＜0.01）。在CD4+ T细胞分别与d28-M-MDSCs、d35-M-MDSCs、d42-M-MDSCs共培养的增殖体系中， IFN-γ的水平也逐渐增高（ p＜0.01 ） ，并且高于与d28-PMN-MDSCs、d35-PMN-MDSCs、d42-PMN-MDSCs共培养增殖体系中IFN-γ的水平。<br>　　将d28-PMN-MDSCs与d28-M-MDSCs分别过继转移转移到CIA小鼠模型中，观察MDSCs亚群对疾病进程的影响。发现与PBS对照组相比，过继转移d28-PMN-MDSCs可以减轻CIA小鼠足趾的肿胀程度，降低临床评分及血清抗CⅡ-IgG的水平（p＜0.01），而过继转移d28-M-MDSCs与PBS对照组相比没有显著差异。上述结果表明，过继转移d28-PMN-MDSCs可以减轻CIA疾病的严重程度，而过继转移d28-M-MDSCs对疾病进程则没有明显影响。<br>　　（2）通过对MDSCs亚群的m6A甲基化水平进行检测发现，d28-PMN-MDSCs的m6A甲基化水平低于佐剂对照组PMN-MDSCs的m6A甲基化水平，d28-M-MDSCs的m6A甲基化水平高于佐剂对照组M-MDSCs的m6A甲基化水平，且MDSCs亚群的m6A甲基化水平在CIA进展过程中逐渐升高。<br>　　通过检测MDSCs亚群中m6A相关酶的表达发现，与对照组相比，甲基化酶METTL3的表达在d28-PMN-MDSCs中降低，在d28-M-MDSCs中升高，随疾病进展METTL3的表达在PMN-MDSCs与M-MDSCs中表达均升高，与MDSCs亚群m6A甲基化水平的变化一致。将PMN-MDSCssi-NC、PMN-MDSCssi-METTL3、M-MDSCssi-NC、M-MDSCssi-METTL3分别加入CD4+ T细胞体外增殖体系，与PMN-MDSCssi-METTL3共培养的CD4+ T细胞的增殖比例（27.350%± 2.150%）明显低于与PMN-MDSCssi-NC共培养的CD4+ T细胞的增殖比例（41.300%± 2.400%）（p＜0.05），与M-MDSCssi-METTL3共培养的CD4+ T细胞的增殖比例（28.500%± 0.300%）低于与M-MDSCssi-NC共培养的CD4+ T细胞的增殖比例（34.250%±1.650%） （p=0.0756）。上述结果表明敲低MDSCs亚群METTL3的表达可以明显增强MDSCs的免疫抑制功能。<br>　　使用METTL3抑制剂STM2457处理MDSCs亚群，发现STM2457处理后，与PMN-MDSCs共培养的CD4+ T细胞的增殖比例从43.267%±1.397%降低到34.500%±2.281%（p＜0.05），与M-MDSCs共培养的CD4+ T细胞的增殖比例从59.100%±2.458%降低到35.933%±3.495%（p＜0.05）。说明抑制METTL3同样可以增强MDSCs亚群的免疫抑制功能。接下来在构建CIA小鼠的过程中使用STM2457进行干预处理，发现与DMSO对照组相比，STM2457干预可以明显减轻CIA小鼠足趾的肿胀程度，降低临床评分及血清抗CⅡ-IgG的水平（p＜0.01）。上述结果说明，METTL3抑制剂干预可以减缓CIA小鼠的发病进程。<br>　　结论：<br>　　在CIA发病早期，MDSCs中METTL3表达显著下调，随疾病进展METTL3表达逐渐升高。METTL3的表达与MDSCs的免疫抑制功能呈负相关。抑制METTL3可以通过m6A-YTHDF2方式上调NOX2及iNOS mRNA的表达，增强MDSCs的免疫抑制功能，缓解CIA小鼠的疾病进程。同时METTL3还可以通过m6A-IGF2BP1方式介导MafB mRNA的稳定性，影响骨髓诱导MDSCs的分化。