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摘要根据2020年全球癌症统计数据，结直肠癌是全球第二大致命癌症（占癌症总死亡率的9.4%）。虽然结直肠癌是最为常见的胃肠道恶性肿瘤，但由于其起病隐匿，很多患者在初诊时就处于晚期，这对人们的生命健康构成很大的威胁。目前常规治疗结直肠癌的方式有手术、化疗和放疗。单一的治疗方式往往对疾病的治疗都较为局限，根据疾病的定位和进展，将各种治疗方式联合使用能够产生更令人满意的疗效。免疫治疗是近期研究较多的治疗方法。PD-L1抑制剂作为较为常用的免疫治疗药物，相关研究发现放疗可以通过多种途径协同PD-L1抑制剂，如促进T细胞浸润，提高PD-L1的表达以及上调肿瘤主要组织相容性复合物I类分子的表达。然而，吞噬作用检查点PD-L1在放射免疫治疗耐药性中的作用仍然很不清楚。<br>　　【研究目的】<br>　　放疗联合免疫治疗取得的疗效已被广泛研究验证，但免疫耐受机制并未完全明确，并不是所有结直肠癌患者群体都能从该方案中获益。本研究通过构建结直肠癌小鼠皮下荷瘤模型，采取不同治疗方式，对经过不同治疗后的基因表达谱进行生物信息学分析，通过研究放疗后PD-L1在中性粒细胞上的表达，探讨引起放疗联合免疫治疗耐药性可能的机制，发现潜在的靶点及可能的治疗方案，以期能够改善结直肠癌患者的疗效。<br>　　【研究方法】<br>　　对皮下荷瘤（MC38）小鼠进行不同处理，对经过处理后的小鼠皮下肿瘤进行转录组测序分析，筛选出各组间的差异表达基因，利用GO数据库对差异表达基因进行通路富集分析，分析PD-L1在各组间的表达差异，利用HPA及Monaco数据库检索PD-L1的表达，绘制测序数据的分析结果图。取出对NC组（无治疗组）、免疫治疗组、放疗组、放疗联合免疫治疗组四种不同处理组小鼠的皮下肿瘤进行流式分析。观察并记录皮下荷瘤的NC组、放疗组、免疫治疗组及放疗联合免疫治疗组间的小鼠的肿瘤体积并绘制肿瘤生长曲线图并分析组间差异，将处理组改为WT组（普通C57小鼠无治疗组）、CSF3R ko组（中性粒细胞缺如小鼠组）及CSF3R ko+RI组（接受放疗联合免疫治疗的中性粒细胞缺如小鼠组）重复观察并记录数据。分组为WT、R+I（接受放疗联合免疫治疗的普通C57小鼠组）、CSF3R ko和CSF3R ko+RI4组，将取出的小鼠皮下肿瘤进行Ki-67染色，分析不同处理组间差异，得出结论。<br>　　【研究结果】<br>　　免疫治疗组和NC组共筛选出1141个差异表达基因，放疗组和NC组共筛选出2039个差异表达基因，放疗联合免疫治疗组和NC组共筛选出2683个差异表达基因。差异表达基因主要富集在生物调节过程、细胞过程、免疫系统、细胞部分、细胞器、连接等过程。FPKM值示PD-L1的表达在接受免疫治疗后表达升高，差异有统计学意义（P＜0.05），在接受放疗后表达显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01），在接受放疗联合免疫治疗后表达也显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）。同时HPA数据库及Monaco数据库提示，PD-L1在中性粒细胞上表达较高。流式细胞术结果提示，经过放疗联合免疫治疗后，肿瘤浸润中性粒细胞表面PD-L1的表达明显提高。对NC组、免疫治疗组、放疗组、放疗联合免疫治疗组四种不同处理组的流式结果进行统计学分析，发现PD-L1+中性粒细胞的表达在放疗联合免疫治疗组与对照组之间的差异有统计学意义（P＜0.05），在放疗联合免疫治疗组与免疫治疗组之间的差异有统计学意义（P＜0.05），在放疗联合免疫治疗组与放疗组之间的差异也有统计学意义（P＜0.05）。皮下荷瘤生长实验示在NC组、放疗组、免疫治疗组及放疗联合免疫治疗组间，放疗联合免疫治疗组小鼠肿瘤体积最小，疗效较好且与其他组间均有显著差异（P＜0.05），而放疗组与免疫治疗组间无显著差异。在WT、CSF3R ko组及CSF3R ko+RI组间，CSF3R ko组及CSF3R ko+RI组疗效较好，三组间均有显著差异（P＜0.05）。Ki-67染色结果示CSF3R ko小鼠经放疗联合免疫治疗后Ki-67阳性率差异显著（P＜0.05），经放疗联合免疫治疗的CSF3R ko小鼠与经放疗联合免疫治疗的WT小鼠相比也表现出显著差异（P＜0.0001），WT小鼠经过放疗联合免疫治疗与无治疗组相比无显著差异。<br>　　【研究结论】<br>　　1.放疗联合免疫治疗后中性粒细胞上PD-L1的表达增高可能与结直肠癌细胞的免疫耐受机制相关。<br>　　2.中性粒细胞缺如能够起到较好抗癌作用，而与放疗联合免疫治疗相结合后疗效更显著，放疗联合免疫治疗的免疫耐受作用可能在中性细胞缺如的小鼠中减弱。