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摘要目的：<br>　　1. 通过细胞分子生物学实验研究桂枝-甘草的主要药效成分桂皮醛、甘草次酸对间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）来源的棕色样脂肪细胞生成的影响；<br>　　2. 通过RNA小干扰技术从PGC1α/FNDC5/UCP1途径探讨桂皮醛联合甘草次酸促进MSC分化为棕色样脂肪细胞的机制。<br>　　方法：<br>　　1. 通过细胞增殖与活性实验（CCK-8）探究桂皮醛（CM）及甘草次酸（GA）对C3H10T1/2 MSC增殖及活性的影响。分别使用不同浓度的CM、GA干预MSC成脂分化，通过油红O染色观察分化后的脂肪细胞形态；Image J软件分析脂滴平均面积；分光光度法评估细胞脂质含量。通过RT-qPCR检测成脂转录基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβmRNA，线粒体生物发生主要调节因子PGC1αmRNA、产热脂肪标志性基因UCP1 mRNA及其他与产热密切相关的基因PRDM16、TBX1、CD137、ELOVL3、DIO2、CITED1 mRNA的相对表达量；通过蛋白印迹实验检测线粒体生物发生调节因子PGC1α、产热脂肪标志性基因UCP1的蛋白表达量；通过免疫荧光染色检测UCP1+细胞的表达情况。<br>　　2. 通过RT-qPCR及蛋白印迹检测FNDC5 mRNA及蛋白的表达。通过FAM荧光标记的NC转染实验筛选最佳转染复合物浓度；通过4个不同序列的FNDC5 siRNA筛选FNDC5干扰效率最高的siFNDC5引物。通过siRNA转染实验敲低FNDC5在MSC中的表达后进行成脂分化及药物干预，使用RT-qPCR及蛋白印迹实验检测PGC1α、FNDC5、UCP1 mRNA及蛋白表达量；通过RT-qPCR检测与产热相关基因CD137、DIO2 mRNA的相对表达量。<br>　　结果：<br>　　1. 桂枝-甘草主要药效成分桂皮醛与甘草次酸促进间充质干细胞向棕色样脂肪细胞分化<br>　　（1）不同浓度CM和GA对C3H10T1/2 MSC增殖率的影响<br>　　CCK-8实验表明20~80μM CM和10~40μM GA可以促进MSC的增殖（P＜0.01）。<br>　　（2）不同浓度CM和GA对C3H10T1/2 MSC脂滴形成的影响<br>　　油红O染色结果显示，20μM、40μM CM和10μM、20μM GA干预组出现了更多的环岛状多房脂房细胞（P＜0.01）；20μM、40μM、80μM CM和10μM、20μM GA可促使脂滴平均面积减小（P＜0.05）；20μM、40μM、80μM CM和10μM GA可抑制脂肪细胞脂质积累（P＜0.05）。<br>　　（3）不同浓度CM和GA对线粒体生物发生调节因子PGC1αmRNA、产热脂肪标志性基因UCP1 mRNA的影响<br>　　RT-qPCR结果显示20μM、40μM CM、80μM CM和10μM、20μM GA可以增加PGC1αmRNA的表达量（P＜0.05），20μM、40μM CM和10μM、20μM GA可以增加UCP1 mRNA的表达量（P＜0.05）。<br>　　（4）CM、GA不同浓度组合对脂肪转录基因PPARγ、C/EBPα、C/EBPβmRNA和线粒体生物发生调节因子PGC1α、产热脂肪特异性基因UCP1的mRNA及蛋白的影响<br>　　依据以上结果，将20μM、40μM CM和10μM、20μM GA两两组合干预MSC成脂分化。与Control组相比，20μM CM联合20μM GA可以增加脂肪转录因子C/EBPα、C/EBPβmRNA水平（P＜0.05），PPARγmRNA水平上升，但无统计学差异。40μM CM+10μM GA促使PGC1α、UCP1 mRNA及UCP1蛋白表达量增加（P＜0.05）；20μM CM+10μM GA促使PGC1α蛋白表达量增加（P＜0.05）；20μM CM+20μM GA促使PGC1α、UCP1 mRNA及PGC1α、UCP1蛋白表达量增加（P＜0.01）。<br>　　（5）CM、GA、CM+GA对C3H10T1/2 MSC脂滴形成的影响<br>　　依据以上实验结果，使用CM（20μM）、GA（20μM）、CM（20μM）+GA（20μM）干预MSC成脂分化。油红O染色结果显示，Control组平均多房脂滴细胞数为7.75±1.708个，CM+GA组平均多房脂滴细胞数为30±30.5.354个，差异有统计学意义（P＜0.01）；与CM或GA组相比，CM+GA组多房脂滴细胞数增加（P＜0.05）。使用Image J软件计算脂滴平均面积，Control组平均脂滴面积179.617±14.819 Pixel，CM+GA组平均脂滴面积147.769±22.999 Pixel，差异有统计学意义（P=0.01）；与GA组相比，CM+GA组平均脂滴面积减少，（P=0.016）。使用酶标仪测定各组吸光度，以此计算相对脂质含量，CM+GA组脂质含量为86.653±4.998%，与Control组（100.003±1.813%）相比有统计学差别（P=0.005）；与GA组相比，CM+GA组脂质含量下降（P＜0.05）。<br>　　（6）CM、GA、CM+GA对线粒体生物发生调节因子PGC1α、产热脂肪特异性基因UCP1的mRNA及蛋白的影响<br>　　与Control组相比，CM+GA组PGC1α、UCP1 mRNA及蛋白表达量增加（P＜0.05）。与CM组相比，CM+GA组PGC1αmRNA及蛋白表达量增加、UCP1蛋白表达量增加（P＜0.05）；与GA组相比，CM+GA组PGC1α 蛋白表达量增加、UCP1 mRNA及蛋白表达量增加（P＜0.05）。<br>　　（7）CM、GA、CM+GA对产热相关基因PRDM16、TBX1、CD137、ELOVL3、DIO2、CITED1 mRNA 的影响<br>　　与Control相比，CM+GA组产热脂肪相关基因TBX1、CD137、ELOVL3、DIO2、CITED1 mRNA的相对表达量上升（P＜0.05），PRDM16 mRNA有上升趋势，但无统计学差异。与CM组相比，CM+GA组CD137 mRNA上升（P＜0.01）；与GA组相比，CM+GA组ELOVL3、DIO2、CITED1 mRNA上升（P＜0.05）。（8）CM、GA、CM+GA干预C3H10T1/2成脂分化后UCP1+细胞表达情况<br>　　免疫荧光染色显示，与Control相比，CM、GA、CM+GA组表达UCP1+的细胞数量增多（P＜0.001），同时UCP1荧光信号增强。与CM或GA组相比， CM+GA组表达UCP1+的细胞数量更多（P＜0.05）。<br>　　2. CM+GA通过PGC1α/FNDC5/UCP1途径促进MSC分化为产热脂肪细胞<br>　　（1）CM和GA对脂肪细胞FNDC5 mRNA及蛋白的影响<br>　　RT-qPCR结果表明，与Control组相比，CM（20、40μM）与GA（20μM）增加了FNDC5 mRNA的表达（P＜0.05）。与Control组相比，CM（20μM）+GA （20μM）组FNDC5 mRNA及蛋白水平升高（P＜0.001）；与CM（20μM）或GA（20μM）组比较，CM（20μM）+GA（20μM）组FNDC5 mRNA及蛋白水平升高（P＜0.05）。<br>　　（2）siRNA转染复合物最佳转染浓度筛选<br>　　使用FAM荧光标记的NC（negative control）转染复合物转染C3H10T1/2 MSC，结果显示siRNA转染复合物浓度为20 nM时达到最佳转染效果。<br>　　（3）siFNDC5最佳转染效果筛选<br>　　分别使用NC、si-A、si-B、si-C、si-D五种不同序列的转染复合物转染C3H10T1/2 MSC。RT-qPCR及蛋白印迹结果显示：与CON组相比，NC组（阴性对照组）FNDC5 mRNA及蛋白水平无统计学差别。与CON组相比，si-D转染后，C3H10T1/2 MSC中的FNDC5 mRNA相对表达量为0.188±0.058，差异有统计学意义（P＜0.001）；与CON组相比，FNDC5蛋白相对表达量为0.509± 0.130，差异有统计学意义（P＜0.01）。<br>　　结论：<br>　　1. 桂皮醛和甘草次酸可以协同促进MSC定向分化为棕色样脂肪细胞，其中20μM桂皮醛联合20μM甘草次酸是最佳的浓度组合。<br>　　2. 桂皮醛联合甘草次酸促进MSC定向分化为棕色样脂肪细胞的作用机制与PGC1α/FNDC5/UCP1信号通路相关。