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摘要脑白质损伤（White matter injury, WMI）是早产儿脑损伤最常见的类型，也是包括脑性瘫痪在内的慢性神经系统疾病的主要病因。据世界卫生组织统计，每年全球约有1500万早产儿。尽管在早产儿护理方面取得的重大进展已经显著提高了极低出生体重早产儿（Very low birth weight ，VLBW）（＜1.5 kg）的生存率，但同时伴随着患有长期神经功能缺损的早产幸存者的数量显著增加。据报道，约10%的早产幸存者有永久性运动障碍。此外，25%-50%的早产幸存者存在认知、视觉、社会行为、注意力和学习障碍。WMI与这些神经功能异常密切相关。遗憾的是，临床上尚无有效药物来预防和治疗WMI。<br>　　脑白质主要是由髓鞘化的神经元轴突组成。髓鞘发育是脑白质发育的最后阶段，髓鞘发育延迟或异常会导致肢体语言和思维功能的障碍。中枢神经系统（Central nervous system，CNS）中髓鞘是成熟少突胶质细胞（Oligodendrocyte，OLs）的细胞质膜包裹轴突形成的结构。形成髓鞘的OLs由少突胶质细胞前体细胞（Oligodendrocyte progenitor cells ，OPCs）分化而来。发育过程中，OPCs首先分化为前少突胶质细胞（Pre-OLs），最终分化为能够产生髓鞘的成熟OLs。除了加快神经冲动的传导速度外，髓鞘还能为轴突提供所需营养。髓鞘发育异常和髓鞘形成障碍是早产儿WMI的主要病理学特征。<br>　　OPCs分化形成髓鞘是一个复杂的过程，除了内源性启动分化程序外，局部微环境对OLs形成髓鞘也具有重要的作用。在发育过程中，神经元活动调节髓鞘动力学和髓鞘形成的轴突选择。神经元活动也可以促进OPCs增殖、分化和髓鞘形成。OPCs与兴奋性和抑制性神经元形成突触，包括谷氨酸和GABA在内的神经递质可以调节OPCs的增殖和分化。<br>　　局部微环境的稳态机制可能在WMI的发生过程中发挥重要作用。内分泌是机体重要的内稳态调节机制，大量研究表明激素调节参与了脑白质发育，且激素表达水平在WMI时发生了显著变化。生长激素（Growth hormone，GH）作为体内影响最广泛的激素之一，与CNS的发育和功能密不可分。GH是一种由垂体分泌的肽类激素，人类怀孕70天时即可在血清中检测到。血液中的生长激素浓度在妊娠中期达到峰值，并且与儿童相比，新生儿的激素水平更高。先天性GH分泌不足的患者除了生长缓慢，也伴有认知功能障碍。已有研究认为GH替代治疗可以改善GH缺乏症患者的认知功能。但是WMI中大脑GH的变化及其调节脑白质发育的作用尚不清楚。为此，本课题围绕GH在低氧诱导的WMI大脑中的变化及其调节髓鞘形成和脑白质发育的作用，从以下四个方面进行研究。（1）WMI模型中GH的表达水平变化及其对髓鞘发育、突触形成和神经功能的作用；（2）人类和小鼠大脑的单细胞RNA测序结果分析及构建转基因荧光报告小鼠探究生长激素受体（Growth hormone recptor，GHR）在大脑中的分布及细胞定位；（3）采用条件性敲除GHR的转基因小鼠，观察GHR对髓鞘形成和脑白质发育的作用，以及明确GHR是否介导GH调控脑白质发育的作用；（4）观察GHR阳性细胞的分布及形态，明确GHR阳性周细胞与内皮细胞的相互作用以及在调节血管形成的过程和作用。<br>　　我们通过ELISA实验，蛋白印迹（WB）、人类和小鼠大脑单细胞RNA测序、构建转基因荧光报告小鼠、免疫荧光染色、特异性敲除GHR的转基因小鼠、双光子显微镜以及行为学实验观察了GHR阳性的细胞在大脑中的分布，探究了GH/GHR在脑白质发育中的作用。主要结果如下：<br>　　1. 慢性低氧小鼠脑组织和血液及新生儿脐带血中GH明显升高，外源性GH治疗能够促进慢性低氧后突触形成、髓鞘修复和神经功能恢复。<br>　　采用ELISA和质谱检测多种激素，发现慢性低氧后（WMI模型）新生小鼠大脑和血液中GH升高。缺氧的新生儿脐带血中GH也明显升高。给予外源性人重组人生长激素（rhGH）治疗WMI小鼠，证明能够促进低氧损伤后的髓鞘形成、突触发育并改善相应的神经功能。提示GH升高可能是机体对缺氧的代偿反应，具有促进WMI髓鞘修复的作用。<br>　　2. GHR阳性细胞主要为周细胞的一个亚群。<br>　　采用单细胞RNA测序的方法，通过分析人类和小鼠大脑的单细胞RNA测序结果证明GHR主要表达于血管细胞，而OPCs和OLs不表达GHR。进一步构建GHR-CreERT的转基因小鼠，进行细胞谱系追踪，证明95%GHR阳性细胞为周细胞，少量为神经元（约4%）和星形胶质细胞（约1%）。GHR阳性的周细胞占NG2或PDGFRβ阳性周细胞的13%-15%。<br>　　3. GHR阳性周细胞对髓鞘形成具有重要的调控作用，周细胞表达的GHR介导了rhGH的促进大脑中髓鞘形成效应，但不能促进离体OPCs分化。<br>　　通过构建特异性诱导GHR阳性细胞凋亡的转基因小鼠（ GHR-CreERT;mT/mG；iDTR）以及周细胞特异性敲除GHR的转基因小鼠（PDGFRβ-CreERT;GHRfl/fl），证明特异性诱导周细胞凋亡或者特异性敲除周细胞上GHR，均导致髓鞘形成减少和OPCs分化障碍，表明GHR阳性周细胞具有调节髓鞘形成的重要作用；敲除周细胞的GHR可以大部分阻断rhGH的促髓鞘形成效应，表明GH的促进髓鞘形成作用是由周细胞上GHR介导的。RhGH直接作于用纯化OPCs，发现OPCs分化程度没有明显改变，并且WB显示OPCs不表达GHR。<br>　　4. GHR阳性周细胞具有尖端细胞（tip cell）形态学特征，通过与内皮细胞相互作用，介导了血管形成，从而间接调节髓鞘形成和神经发育。<br>　　经rhGH处理的OPC-周细胞共培养体系中OPCs和成熟OLs没有显著变化，表明激活周细胞上的GHR可能不是通过分泌机制直接促进OPC分化。采用GHR-CreERT;mT/mG报告基因小鼠，超高分辨共聚焦成像及3D重建显示，发现GHR阳性细胞具有类似于内皮尖端细胞（Endothelial tip cell，ETC）的形态学特征，被命名为周细胞尖端细胞（Pericyte tip cell, PTC）。双光子显微镜观察发现PTC的极化丝状伪足，可以不断伸缩，沿极化方向迁移。3D重建发现GHR阳性细胞与内皮细胞相互作用来调节血管形成，且低氧、GH治疗可以显著增加GHR阳性细胞，同时增加血管形成；反之，诱导GHR阳性周细胞凋亡，或者敲除周细胞的GHR，血管形成减少，同时阻断了GH的促血管形成效应。以上结果表明，GHR阳性周细胞通过调节血管形成，介导了生长激素促髓鞘形成效应。<br>　　综上所述，本课题的研究结果证明GH在小鼠大脑和新生儿脐带血中明显升高是机体对缺氧的一种代偿反应，rhGH治疗可以促进髓鞘形成及功能恢复。GHR阳性细胞主要为周细胞的一个亚群，具有调节髓鞘形成的重要功能，但不是通过直接调节OPCs分化来发挥作用。GHR阳性PTC通过与内皮细胞相互作用，介导血管形成，从而间接调控髓鞘形成。以上研究揭示了生长激素调节脑白质发育的作用和机制，为解析低氧引发的髓鞘发育异常提供了重要线索，为靶向GHR或其下游效应分子治疗WMI提供了理论基础，并为WMI提供了新的治疗策略和方法。