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摘要目的：<br>　　透明细胞肾细胞癌（Clear cell renal cell carcinoma, ccRCC）是泌尿系肿瘤中最为常见的恶性肿瘤之一，其预后两极分化，尤其是对于进展期肾癌而言，单纯的手术治疗已无法实现肿瘤的根治。近年来，尽管靶向治疗和免疫治疗已被证实在晚期肾癌的治疗中具有一定的前景，但真正实现肾癌的治愈仍旧需要克服较大的困难，因此不断探索在肾癌发展中有重要意义的新基因至关重要。目前，国内外的多项研究表明热休克蛋白HSPA5在多种肿瘤中都呈现高水平表达，且与患者预后显著相关，但其在肾透明细胞癌发生发展中的作用尚不清楚。因此本课题以 HSPA5 在公共数据库 TCGA 中的生物信息学分析为出发点，拟通过慢病毒转染、细胞表型检测、耐药细胞株的培育以及免疫组化染色等技术手段，来探究热休克蛋白HSPA5在ccRCC的临床预后和药物耐药方面的价值，并初步揭示其参与调控 ccRCC 发展的潜在分子机制，尝试为 ccRCC 新型治疗干预措施的开发提供一定的理论和实践基础。<br>　　材料和方法：<br>　　基于公共数据库TCGA的转录组测序数据和GTEx数据库中的正常组织的测序结果，分析比较了热休克蛋白HSPA5在泛癌组织下的肿瘤及非肿瘤组织间的表达差异。使用ROC曲线来寻找HSPA5的最佳截断值，并以此对整个TCGA-KIRC数据集进行分组，进而探寻HSPA5的表达差异与常见临床病理参数、生存预后间的关系。此外，还使用生物信息学的方法对不同HSPA5表达组之间的免疫浸润和免疫抑制情况进行比较，并用JAVELIN Renal 101队列的数据对上述免疫相关的分析结果进行验证。随后，通过对高、低HSPA5表达组间的差异基因进行富集分析，我们探索了与HSPA5相关的潜在分子通路。同时，借助于r 语言的“pRRophetic”包分析比较了不同 HSPA5 表达组对诸多肿瘤治疗药物的敏感性差异。<br>　　细胞实验中，首先通过使用慢病毒感染肾癌细胞系，构建得到了稳转敲低细胞株（sh-HSPA5#2、sh-HSPA5#3）、稳转敲低对照细胞株（sh-NC）、稳转过表达细胞株（OE-HSPA5）和稳转过表达对照细胞株（OEC）。随后使用CCK-8 法来检测不同稳转细胞株的增殖能力；使用平板克隆形成实验检测各稳转细胞株的集落形成能力；使用细胞划痕实验和 Transwell 实验来检测各稳转细胞株的侵袭和迁移能力的变化；又通过流式细胞学的方法来检测各稳转细胞株的凋亡情况；还使用 GSHamp;GSSG 检测试剂盒检测了各稳转细胞株的 GSH/GSSG的比值变化，用以评估其铁死亡发生的情况；同时联合HSPA5干预与铁死亡激动剂，使用CCK-8法检测了各稳转细胞株的增殖水平变化；并用Western Blot的实验方法验证了生信分析中所富集出的通路在各稳转细胞株中的改变情况；最后，我们又诱导构建了肾癌细胞系的舒尼替尼耐药株，并通过检测细胞的半数抑制浓度IC50在耐药细胞株的各稳转株间的变化，来探寻热休克蛋白HSPA5在肾透明细胞癌舒尼替尼耐药中的作用。<br>　　最后，我们使用本中心的WCH-ccRCC队列进行HSPA5的免疫组化染色并评分，再次验证了热休克蛋白HSPA5在肿瘤组织、癌旁组织以及正常组织间的表达差异，并一同验证了HSPA5的免疫组化评分与所收集整理的临床病理参数、生存预后间的关系。<br>　　结果：<br>　　1.通过对TCGA中泛癌数据的分析，我们发现：热休克蛋白HSPA5在绝大多数肿瘤中都呈现高水平表达，随后，我们又对 TCGA-KIRC 数据集进行了更为深入的生信分析，发现：更高病理T、N分期、更高病理分级的肾透明细胞癌患者往往具有更高的HSPA5表达水平，且HSPA5高表达组的患者生存预后也更差。HSPA5高、低表达组间差异基因的富集分析也表明HSPA5与PI3K-AKT通路、mTOR通路、MAPK通路以及铁死亡通路都有密切的关系，并与金属离子的跨膜转运蛋白的活性、膜微结构域、单核/淋巴细胞的分化有关。此外，生信分析还表明HSPA5 高表达往往可能预示着更明显的抗肿瘤免疫反应的抑制，更可能从免疫检查点抑制剂的治疗中获益；同时，有关HSPA5药物敏感性的生信分析发现：热休克蛋白HSPA5的表达水平对肾透明细胞癌患者多种药物敏感性的选择上其实具有一定的指导意义。<br>　　2.细胞表型实验发现敲低HSPA5后，肾癌细胞系的增殖能力、侵袭及迁移能力、集落-克隆形成的能力均显著减弱，凋亡水平增加；而在过表达HSPA5后，肾癌细胞系的增殖能力、侵袭及迁移能力、集落-克隆形成的能力又会有一定程度的增强，凋亡水平也会出现一定程度的减弱。此外，HSPA5的过表达可以一定程度上回复铁死亡激动剂Erastin和RSL3所引起的肾癌细胞系增殖能力的降低，且下调HSPA5的表达水平可以在一定程度上恢复肾癌细胞系对舒尼替尼的药物敏感性。<br>　　3.通过 Western Blot 实验对各稳转细胞株蛋白层面的检测，我们发现敲低HSPA5可以抑制PI3K-AKT、mTOR以及ERK1/2等分子信号轴的激活，降低GPX4的蛋白表达，代偿性地引起SLC7A11的表达水平增加，使得GSH/GSSG的比值升高；而过表达HSPA5可以促进PI3K-AKT、mTOR以及ERK1/2等分子信号轴的激活，抑制 GPX4 蛋白的降解，代偿性地下调 SLC7A11 的表达水平，使得GSH/GSSG的比值下降。<br>　　4.基于上述结果，我们再次使用本中心肾癌队列的临床标本，对肿瘤组织、癌旁组织以及正常肾实质组织的HSPA5蛋白表达水平进行验证，确认了热休克蛋白HSPA5在肾癌肿瘤组织中的高表达，且这种高表达状态与肾癌更高的病理T、N分期、更高的病理分级、肿瘤合并坏死、癌栓、肉瘤样分化及术后出现不良反应等参数显著相关，同时，进一步的单因素及多因素cox回归分析也证实：HSPA5的免疫组化评分是本中心肾癌患者无进展生存PFS的独立预测因素。<br>　　结论：<br>　　1.热休克蛋白HSPA5在肾透明细胞癌中呈高表达水平，且这种高表达状态与更高的病理T、N分期、更高的病理分级、肿瘤合并坏死、癌栓、肉瘤样分化及术后出现不良反应等肾透明细胞癌的诸多恶性因素显著相关，且HSPA5高表达组患者往往预后更差。<br>　　2.热休克蛋白HSPA5可促进肾癌细胞系的增殖、侵袭、迁移以及克隆形成的恶性表型，并抑制肾癌细胞系的凋亡发生，且HSPA5的过表达可以一定程度上回复铁死亡激动剂Erastin和RSL3所引起的肾癌细胞系增殖能力的降低。<br>　　3.热休克蛋白HSPA5可通过激活PI3K-AKT、mTOR和ERK1/2通路来促进肾癌细胞的进展，并通过抑制GPX4的降解来降低肾癌细胞铁死亡的发生。<br>　　4.热休克蛋白 HSPA5 可能参与了肾癌舒尼替尼耐药的过程，下调 HSPA5的表达水平可以在一定程度上恢复肾癌细胞系对舒尼替尼的药物敏感性。