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摘要牙周炎是导致成年人失牙的最主要原因之一，以龈下菌斑为始动因子，对口腔牙周软硬组织产生慢性破坏作用，其发生发展过程至今尚未被被详细阐释。截止目前的研究结果显示，复杂种类的口腔微生物所产生的毒力因子以及宿主本身免疫所致的炎症反应在该病的发生、发展中起着关键的作用。<br>　　作为大麻叶提取物中少有安全、无成瘾性精神风险的提取物，大麻二酚（Cannabidiol，CBD）具有强效的抑炎、镇痛、调节免疫特性，可作用于多组织器官，影响疾病发生发展过程，但其在口腔领域的作用尚未被完全开发。<br>　　米诺环素（Minocycline，MINO）是二代四环素类广谱抗生素，目前在临床上已被广泛用于治疗口腔感染性疾病，对于多种革兰氏阳性及阴性细菌生长繁殖的抑制作用均较强，可有效降低口腔致病微生物毒力，但其缓解宿主免疫所引起的炎症反应的效果较弱。对于牙周炎感染人群而言，通常由细菌引起的牙周组织炎症反应剧烈，从而容易出现牙龈肿胀、出血、疼痛及牙齿松动等表现，而至此阶段单纯依靠米诺环素无法得到有效缓解。因此，改善宿主免疫所引起的局部炎症反应也是治疗牙周炎的目标之一。<br>　　本课题拟探究大麻二酚联合米诺环素对牙周炎优于单体药物的治疗作用。两种药物在牙周炎治疗过程中各自主要承担不同功能，其联用效果是否优于传统单一的药物疗法，从抑制致病微生物生长及抑制宿主炎症反应两方面分别出发，探究联合药物使用中各方面的功能表现，并开展体内外实验对其疗效及机制进行相关探究。<br>　　课题主要分为以下几部分实验：<br>　　1. 大麻二酚联合米诺环素治疗牙周炎的疗效分析<br>　　采用丝线结扎法建立小鼠牙周炎模型，局部给予口腔联合喷剂七天，每日监测其临床体征变化，七天后收样分析体内炎症微环境变化及软硬组织破坏情况。通过收集牙周结扎丝线进行16sRNA微生物组测序，分析联用药物对牙周菌群的影响。<br>　　2. 大麻二酚联合米诺环素的体外抑菌实验<br>　　分别选取革兰氏阳性及阴性菌的代表菌种，探究针对不同菌种的最佳CBD及MINO组合浓度。借助一系列表征方法，探究联用大麻二酚及米诺环素后对悬浮生长及定植于菌斑生物膜中不同类型细菌的广谱抗菌性能。<br>　　3. 大麻二酚联合米诺环素抗炎作用的体外研究<br>　　体外采用 CBD 及 MINO 处理炎症状态的小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（RAW264.7细胞）及牙龈成纤维细胞（HGF），探索联用CBD及MINO较单独使用 CBD 而言，是否具有更强的抗炎、影响细胞增殖、迁移、胶原生成等效果。<br>　　4. 大麻二酚联合米诺环素抑制炎症小体激活及细胞焦亡<br>　　课题组前期研究发现，CBD可显著抑制人口腔上皮角质细胞NLRP3炎症小体激活及下游细胞焦亡通路，本实验即研究联用CBD及MINO是否也是通过此途径降低炎症反应及细胞焦亡。<br>　　本课题的研究结果如下：<br>　　1. 联用大麻二酚与米诺环素对小鼠牙周炎，较单独应用药物具有更为理想的疗效。相较于单用米诺环素的传统牙周炎治疗方案，局部联合应用大麻二酚及米诺环素后，在相对传统用法更低的米诺环素用量下，牙周炎小鼠体重恢复加快，全身外周血炎症指标降低，局部牙周炎相关临床表征（牙龈出血及菌斑指数）缓解，并可明显减轻局部软硬组织在牙周炎下的炎症损伤程度，促进牙周纤维组织愈合。微生物组测序结果显示联用大麻二酚及米诺环素显著改变小鼠牙周微生物群落组成结构，或对牙周炎进展具有一定影响。<br>　　2. 大麻二酚与米诺环素联用表现出良好的广谱抗菌性能。通过设计组合浓度实验，探究得出最低抑菌浓度组合为1μg/mLCBD+0.06μg/mLMINO。针对悬浮态细菌绘制生长曲线，结合抑菌环实验，联用药物的最低抑菌浓度有效可在溶液中抑制细菌增殖；对于定植于菌斑生物膜中的细菌，CBD+MNO可影响其生物膜结构组成，降低其细胞外基质含量，进而削弱其毒力。<br>　　3. 大麻二酚与米诺环素联用可有效降低炎症状态下巨噬细胞多种炎症因子的表达水平，同时促进炎症状态下人牙龈成纤维细胞增殖、迁移，提升其胶原形成功能。<br>　　4. 联用大麻二酚及米诺环素通过抑制牙周组织细胞 NLRP3 炎症小体的激活及细胞焦亡，从而改善牙周炎环境下的组织破环。<br>　　综上所述，本课题创新性提出局部联合应用大麻二酚及米诺环素，在相较传统单一用法更低的米诺环素用量下，体内实验证实其对牙周炎疗效更优，体外抗菌实验探究证实大麻二酚及米诺环素联用具有广谱的抑制细菌增殖及抗细菌生物膜的作用，体外细胞实验结果表明二者联用在炎症状态下抑制巨噬细胞炎症因子分泌，促进炎症下牙龈成纤维细胞胶原形成功能恢复。究其机制，与联用药物抑制牙周组织细胞 NLRP3 炎症小体的激活及细胞焦亡，以及改变牙周微生物群落组成有关。本实验研究结果有望为临床探索牙周炎治疗方法提供新思路。