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摘要目的：<br>　　糖基化修饰是指在相应的糖基转移酶的催化作用下，在蛋白质或脂质上附加糖链，其中包括N-聚糖，O-聚糖或单糖唾液酸。唾液酸O-糖基化修饰糖蛋白是一类被O-糖基化修饰，唾液酸再修饰O-糖基化末端的糖蛋白。哺乳动物精子表面在精子发生、成熟以及与精浆接触过程中形成一层厚厚的糖萼。已有文章报道在精子获能过程中精子表面糖萼发生变化参与顶体反应发生和精卵识别，但精子表面糖萼参与精子受精过程的具体分子机制仍尚待揭示。因此，本研究旨在探讨O-聚糖及其末端唾液酸在获能过程中的变化、对精子功能和精卵结合的影响。<br>　　材料和方法：<br>　　1、精子来源：2021年2月至2023年2月在华西第二医院生殖医学男科收集精液样本（伦理审批编号：2019050）。2021年10月至2023年2月在湖南省杜洛克种猪有限公司购买杜洛克猪精液样本。<br>　　2、唾液酸化O-糖基化修饰糖蛋白定位及定量：人类精子和猪精子通过获能实验后，采用凝集素流式细胞术、凝集素印迹法和凝集素荧光标记法检测获能前后人类和猪精子表面唾液酸化和唾液酸化O-糖基化修饰变化。<br>　　3、筛选猪精子获能前后唾液酸化O-糖基化修饰差异蛋白：对获能前后的猪精子采用Jacalin（木菠萝凝集素）富集差异唾液酸化O-糖基化修饰糖蛋白，通过纳升液相联三合一超高分辨率质谱仪进行分析。参考Sus scrofa（野猪）蛋白质组数据对我们的质谱数据进行检索，然后再使用悟空云平台对蛋白质组数据进行数据前处理、统计分析和功能分析，寻找差异性蛋白并分析其功能。<br>　　4、唾液酸化O-糖基化修饰对精子功能的影响：采用外源性O-糖苷酶和唾液酸酶酶切法水解精子表面的唾液酸和O-聚糖，通过CASA精子分析仪检测精子活力，流式法检测精子活率、线粒体膜电位，以反应其对精子功能的影响。<br>　　5、唾液酸化O-糖基化修饰对精卵结合的影响：通过猪精子获能实验、猪体外受精、蛋白质印迹法（Western Blot , WB）、糖苷酶水解法、透明质酸酶酶谱法和免疫荧光等技术检测唾液酸化O-糖基化修饰对精卵结合的影响。<br>　　结果：<br>　　1、人类精子获能前后唾液酸化O-糖基化修饰变化结果：凝集素流式细胞术结果显示 α2-3唾液酸（MAL-II(怀槐凝集素II)识别）和 α2-6唾液酸（SNA(黑接骨木凝集素)识别）获能过程中脱落。唾液酸化O-糖基化修饰（Jacalin识别）根据荧光强度分为两群，获能后荧光强度强的一群占比升高，说明获能后人类精子膜表面唾液酸脱落，唾液酸化O-糖基化修饰增多。凝集素印迹法结果显示获能过程中，精子表面的糖萼变化呈动态变化，Jacalin识别的唾液酸化O-糖基化修饰在180 kDa左右减少，55 kDa左右上增加；SNA识别的 α2-6唾液酸在90 kDa左右减少，80 kDa左右增加；MAL-II识别的 α2-3唾液酸在110 kDa左右减少，70 kDa左右增加。凝集素荧光标记法结果显示获能前Jacalin识别的唾液酸化O-糖基化修饰糖蛋白在人类精子整个头部分布，获能后精子顶体信号增强。<br>　　2、猪精子获能前后唾液酸化O-糖基化修饰变化结果：凝集素流式细胞术结果显示猪精子获能过程中主要脱落的是 α2-6连接的唾液酸，唾液酸化O-聚糖信号强度呈现两群，获能后荧光强度强的一群占比升高。凝集素印迹法结果显示精子表面 α2-3唾液酸水平相对较低，猪精子表面唾液酸和O-聚糖的变化呈动态变化，获能后Jacalin识别的唾液酸化O-糖基化修饰在115 kDa 左右增加，45 kDa和15 kDa减少；SNA识别的 α2-6唾液酸在45 kDa左右减少，35 kDa左右增加；MAL-II识别的 α2-3唾液酸在45 kDa和15 kDa左右减少。凝集素荧光标记法结果显示获能前Jacalin识别的唾液酸化O-糖基化修饰糖蛋白集中分布于猪精子赤道板区，获能后猪精子顶体区的信号增强。<br>　　3、筛选猪精子获能前后脂筏内唾液酸化O-糖基化修饰差异蛋白结果：凝集素Jacalin富集获能前后猪精子脂筏内唾液酸化O-糖基化修饰蛋白，考马斯亮蓝染色结果显示获能前后脂筏内唾液酸化O-糖基化修饰变化显著。结合蛋白质组学分析共富集分析猪精子脂筏糖蛋白1242个。结果分析如下，主成分分析（PCA）结果显示获能前猪样本间个体差异大，其中5号和2号样本与其它相比差异大。获能后2号和3号差异性大。火山图和热图结果显示下调糖蛋白有37个（P＜0.05），其中显著下调（Fold. Changelt;-5）糖蛋白仅有8个；上调糖蛋白有140个（P＜0.05），其中显著上调（Fold. Change＞5）糖蛋白有17个。对显著差异性糖蛋白功能进行分析发现主要与精子运动性和透明质酸酶活性相关。<br>　　4、唾液酸化O-糖基化修饰对精子活力的影响：外源性唾液酸酶能够水解唾液酸，O-糖苷酶能水解O-聚糖，两者联合使用能水解唾液酸化O-聚糖。用这两种糖苷酶处理猪精子结果显示：糖苷酶处理对精子活率、线粒体膜电位和细胞内钙离子浓度的影响无统计学意义（P＞0.05），对精子的生理状态无影响。O-糖苷酶单独处理影响猪精子前向运动（P＜0.05），唾液酸酶处理无统计学意义（P＞0.05），O-糖苷酶和唾液酸酶处理影响精子前向运动（P＜0.05）。而唾液酸酶和O-糖苷酶处理显著影响人类精子前向运动（P＜0.01）。此外，流式结果显示正常精液样本（PR≥32）和异常精液样本（PR＜32）的精子膜蛋白唾液酸化O-糖基化修饰的差异有统计学意义（P＜0.05），异常精液样本的精子膜表面唾液酸化O-糖基化修饰低于正常精液样本的精子。凝集素印迹法检测精子全蛋白，结果无统计学意义（P＞0.05）。<br>　　5、唾液酸化O-糖基化修饰对精卵结合的影响：SPAM1(透明质酸酶PH20前体)是精子的透明质酸酶，是具有丰富糖基化修饰的糖蛋白。WB结果显示， SPAM1在猪精子上主要有三种形式，分子量大小大概是70 kDa，55 kDa，45 kDa；在获能过程中55 kDa的SPAM1从猪精子表面脱落至精子获能液中；凝集素Jacalin富集猪精子脂筏内的SPAM1结果显示70 kDa和55 kDa的SPAM1是唾液酸化O-糖基化修饰的，Jacalin富集获能液中的SPAM1结果显示脱落至获能液中的55 kDa SPAM1是去唾液酸化O-糖基化修饰的；透明质酸酶谱法检测结果显示，只有获能后获能液中55 kDa SPAM1具有透明质酸酶活性。此外，猪体外受精实验结果显示，糖苷酶（O-糖苷酶和唾液酸酶）处理影响精子结合到卵母细胞上的数量（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1、人类和猪精子获能后，表面唾液酸化修饰脱落，具有唾液酸化O-糖基化修饰的糖蛋白在精子顶体表达增多。<br>　　2、唾液酸化O-糖基化修饰与精子前向运动相关。<br>　　3、猪精子获能过程，其表面SPAM1由不可溶性转为可溶性伴随着去唾液酸化O-糖基化修饰，且透明质酸酶活性增强。<br>　　4、猪精子表面唾液酸化O-聚糖，尤其是O-聚糖的脱落促进精卵结合。