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摘要目的：<br>　　血栓是引起大多数心血管疾病的主要因素，严重威胁着人类的健康和生命。手术切除血栓或静脉注射溶栓药物是临床上治疗血栓性疾病的主要方法。然而，溶栓药物的治疗指数窄、半衰期短和出血风险等缺点使其溶栓效率降低，导致其临床应用受到极大的限制。如何提高溶栓效率是血栓治疗中亟待解决的问题。由于血栓部位微环境存在大量炎症因子，本研究开发了一种基于透明质酸（HA）的炎症微环境的靶向释药体系，通过装载溶栓药物以提高其溶栓效率。<br>　　鉴于纳米酶在疾病诊疗中抗氧化及成像的辅助作用，开发含有纳米酶的精准释药体系不仅能够有效提高溶栓效率，还能辅助血栓诊疗成像。Ir 纳米材料具有多种酶类活性可以清除过多的 ROS，还具有高 X 射线吸收能力，可用于CT成像。因此，本研究开发了一种含有纳米酶的血栓微环境靶向递药系统，以C18接枝的HA（HA-C18）为载体，在自组装过程中同时装载溶栓药物蚓激酶（LK）和金属铱单质（Ir NPs），形成多功能溶栓剂Ir-LK@HA，用于溶栓治疗和血栓微环境的改善及血栓成像。<br>　　材料和方法：<br>　　本课题首先构建纳米递药系统Ir-LK@HA。以PVP作为稳定剂，通过前体IrCl3溶液的酒精还原反应合成Ir单质，即Ir-PVP NPs。为了构建具有血栓微环境响应性能的可自组装纳米载体，通过 EDS/NHS 反应对 HA进行表面羧基化修饰后接枝C18分子，得到两亲性分子HA-C18。随后通过核磁共振仪测定HA-C18的氢谱，计算C18接枝率。最后在冰浴超声条件下HA-C18在自组装过程中同时负载LK和Ir-PVP NPs,得到最终的多功能纳米递药系统Ir-LK@HA。通过透射电镜（TEM）、原子力显微镜（AFM）、纳米粒度电位仪、傅里叶变换红外光谱仪（FTIR）、紫外分光光度计、X 射线光电子能谱仪（XPS）、元素分析（EDS）对 Ir-PVP NPs和 Ir-LK@HA进行一系列形态和结构的表征。使用BCA蛋白定量试剂盒测定LK负载率和包封率。通过ICP-MS检测Ir在纳米颗粒中的负载率。随后，通过溶血率、细胞存活率检测血液相容性和生物相容性。通过溶血实验检测溶血率，采用CCK8检测细胞存活率。然后，通过溶解氧含量、•OH和•O2-清除率、ABTS· 含量、总ROS水平、H2O2下的细胞活力验证了Ir-PVP NPs 和 Ir-LK@HA清除自由基的能力。通过便携式溶解氧计测定类CAT活性，通过TMB显色反应和ESR实验检测•OH清除率，通过EPR实验测定类SOD活性，采用ABTS试剂盒测定总抗氧化能力，采用DCFH-DA检测总ROS水平，采用CCK8检测H2O2下的细胞活力。<br>　　其次，为了验证Ir-LK@HA的溶栓能力，采用体外模拟溶栓实验评价其体外溶栓作用。通过检测体外血凝块实验中溶栓前后的血凝块重量变化以及溶栓后血栓上清液的吸光度评价体外溶栓作用，通过 SEM 成像观察血栓溶解前后的形态变化来评价纳米体系的溶栓效果。接下来，为了进一步评价Ir-LK@HA在体内血栓的富集能力和体内溶栓作用，通过三氯化铁（ferric chloride，FeCl3）处理颈总动脉构建动脉血栓模型进行验证。采用小动物高频超声成像系统（VEVO 3100）和激光散斑血流成像系统（RFSLI ZW/RFLSI Ⅲ）检测颈动脉的血流变化以及评估血栓溶解情况。通过MicroCT验证Ir-PVP NPs的CT成像性能以及Ir-LK@HA在体内血栓的富集能力。采用Hamp;E染色观察并评估颈动脉组织的血栓溶解程度，采用蛋白酶K检测颈动脉组织中剩余血栓含量，通过SEM成像观察颈动脉组织中血栓成分紧密程度及血栓形态。此外，为了验证Ir-LK@HA在体内应用的安全性，通过记录尾出血时间评估小鼠的出血风险，通过Hamp;E染色观察小鼠主要器官（心、肝、脾、肺、肾）的组织结构变化情况，通过记录连续用药后体重变化评价小鼠生理状态差异。<br>　　最后，在小鼠体内探索Ir-LK@HA溶栓的可能机制。采用Elisa检测炎性因子，采用NBT法检测血栓组织SOD活性、比色法检测血栓组织MDA活性，采用Westren-blot检测Ir-LK@HA对Nrf2/HO-1通路蛋白的影响，采用DHE染色检测血栓组织的ROS水平。<br>　　结果：<br>　　（1）制备负载LK和Ir-PVP的聚合物胶束Ir-LK@HA。实验结果表明， Ir-LK@HA成功制备，LK的药物装载效率（LE）和封装效率（EE）分别为64.7%和25.2%。通过ICP-MS测定，材料中Ir的含量约为8.7%。负载LK和Ir-PVP后，Ir-LK@HA的平均水动力直径由294.0 ± 2.2 nm增加为336.7 ± 6.4 nm，Ir-LK@HA的zeta电位为 -31.5 ± 0.4 mV。稳定性实验结果表明在室温下储存在PBS溶液中5天后，Ir-LK@HA胶束的尺寸没有明显变化。此外，TEM结果显示Ir-LK@HA为190 nm左右的球形纳米颗粒，AFM也进一步表明其具有均匀的尺寸形态和单分散性。元素分析结果显示，Ir元素均匀地分散在整个纳米颗粒中；紫外分光光度计结果进一步说明 LK和Ir-PVP成功封装在HA胶束内，形成了Ir-LK@HA。<br>　　（2）Ir-LK@HA清除ROS的能力及其生物安全性评价。研究结果表明， Ir-PVP能够有效清除多种自由基，如•OH、•O2-和H2O2。溶解氧含量测定结果显示Ir-PVP能够有效催化H2O2生成O2，且催化活性随温度升高而增加。总抗氧化能力实验结果表明50μg/mL Ir-PVP 能够消除超过80%的ABTS自由基。体外 H2O2实验结果表明 Ir-LK@HA 能够减少 H2O2诱导的巨噬细胞（RAW 264.7）氧化应激损伤。Ir-LK@HA在200μg/mL的材料浓度下，能够将细胞死亡率从33.0%降低至11.7%。体外ROS荧光检测结果显示Ir-LK@HA能够有效降低活化血小板细胞内的ROS水平。此外， Ir-LK@HA在浓度为0-800μg/mL时溶血率均低于6%，证实了它的血液相容性。细胞存活率结果表明Ir-LK@HA在浓度为800 μg/mL时RAW 264.7细胞仍保持91.0%的高存活率。这说明Ir-LK@HA具有优异的清除ROS能力及良好的生物安全性。<br>　　（3） Ir-LK@HA在体内外的溶栓作用评价。体外结果表明，Ir-LK@HA在体外能够有效溶解血栓，溶栓率约为53%，并且能够显著降低血凝块的凝血密度和纤维蛋白交联程度。通过使用 FeCl3 构建体内小鼠颈动脉血栓模型， MicroCT成像结果表明，Ir-LK@HA在血栓部位快速富集，在2 h达到最高值。体内结果显示，Ir-LK@HA的溶栓效果与游离LK相比明显增强，治疗24 h后血流恢复至 59.7%，表现出优异的溶栓能力。此外，尾出血实验结果表明，Ir-LK@HA组的尾出血时间较游离LK组显著减少，表明其能够有效降低游离LK引发的出血风险副作用。本研究还通过给药后观察小鼠的体重变化和主要器官的组织病理学改变等方面验证了 Ir-LK@HA 在体内应用时具有良好的安全性。<br>　　（ 4 ） Ir-LK@HA 改善血栓微环境的可能机制探索。研究结果发现 Ir-LK@HA 明显降低小鼠血清中 TNF-α、sCD40L 炎性因子的水平，增加血栓组织中SOD酶活性水平，并显著降低了脂质过氧化水平（MDA）。同时，Ir-LK@HA显著上调抗氧化应激蛋白Nrf2/HO-1的表达，并且有效降低了血栓组织中ROS水平。这说明Ir-LK@HA可在血栓部位富集，进而通过抗炎与抗氧化应激作用有效改善血栓微环境，提高溶栓效率。<br>　　结论：<br>　　本研究成功构建Ir-LK@HA靶向纳米递药系统，并证实：1）Ir-LK@HA具有实时 CT 成像功能并主动靶向血栓炎症微环境，显著提高药物溶栓效率；2） Ir-LK@HA可通过抗炎与抗氧化应激作用有效改善血栓微环境。