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摘要β-内酰胺类抗生素是临床常用的一类抗菌药物，其功效受到日益严重的细菌耐药问题的威胁。细菌对β-内酰胺类抗生素耐药的主要机制是产生β-内酰胺酶。根据结构和催化机制的不同，β-内酰胺酶通常被分为丝氨酸 β-内酰胺酶（SBL）和金属 β-内酰胺酶（MBL）。近年来已有多个 SBL 抑制剂上市，如阿维巴坦等，其与恰当的β-内酰胺抗生素联用能有效对抗SBL介导的细菌耐药，在临床上发挥着不可替代的作用。针对MBL，目前已经研发了多种不同骨架的抑制剂，苯并环硼酸类化合物Taniborbactam（VNRX-5133）和QPX7728（两者均为MBL/SBL抑制剂）目前分别处于临床III期和I期评价，但迄今尚无MBL抑制剂被批准上市；临床上缺乏有效手段来对抗MBL介导或MBL/SBL双重介导的耐药菌，是亟待解决的关键科学问题。<br>　　根据氨基酸序列和结构特征，MBL还可以进一步被分为B1、B2和B3三类，其中 B1 类 MBL 与临床最为相关，例如 NDMs （ New Delhi Metallo-β-lactamases）、VIMs（Verona Integrin-encoded Metallo-β-lactamases）和IMPs（Imipenemases）。MBL 可以水解包括碳青霉烯在内的几乎所有 β-内酰胺类抗生素（除单环类外），最近有研究表明MBL对非β-内酰胺类的SBL抑制剂Avibactam 也具有较弱的水解活性。同时，MBL 基因可通过可移动的遗传元件结合到病原菌的染色体中，表明其具有广泛传播的潜力，目前已经发现了超过800种MBL，提示MBL介导的细菌耐药问题应该受到国内外广泛关注。因此，当前仍需研发新型、广谱的MBL抑制剂。<br>　　为了更好地进行广谱MBL抑制剂的设计和筛选，本论文针对临床最为重要的B1、B2和B3类MBL的β-内酰胺底物偏好性进行了比较研究。首先，选择了代表性的7个酶进行表达和纯化，分别是B1类NDM-1、VIM-2和IMP-1， B2类CphA和Sfh-I，B3类L1和GOB-18。随后，通过酶动力学参数测试，评价了这 7 个酶对青霉素类、头孢类和碳青霉烯类底物的水解能力；结果表明， B1类MBL水解头孢唑林的能力更强，B3类MBL水解氨苄西林和美罗培南的能力相当，B2类只能有效地水解碳青霉烯类的美罗培南和厄他培南。针对三个家族唯一的共同底物碳青霉烯类，进一步通过紫外吸收波谱检测美罗培南和厄他培南水解产物的变化；未能观察到B1、B2和B3类MBL水解产物的不同波谱现象，说明测试条件下可能未产生不同的水解产物。接下来，通过分子对接模拟研究了碳青霉烯及其开环水解产物与 IMP-1、Sfh-I 和 L1 的结合模式；结果显示，碳青霉烯的开环水解产物均能够通过其吡咯环以及环上的 C3-羧酸与MBL共有的Zn2和锚定残基相互作用。总之，虽然B1、B2和B3类MBL具有不同的底物偏好和底物结合模式，但是三者与碳青霉烯开环水解产物共同的结合模式可以为广谱抑制剂设计提供参考。<br>　　基于上述结果，我们设想若化合物能够模拟碳青霉烯开环水解产物结合模式，即作用于B1、B2和B3类MBL活性位点共有结构特征（如Zn2和锚定残基），将有可能发挥广谱MBL抑制活性。为此，课题组基于前期发现的咪唑-2-羧酸类MBL抑制剂，设计并合成了一系列以2-氨基噻唑-4-羧酸（简称ACA）为母核的化合物，旨在获得广谱MBL抑制剂，逆转细菌对碳青霉烯类抗生素的耐药性。首先，在C-5位进行了结构修饰得到了化合物ACA-1—ACA-18，这些化合物对B1类MBL的抑制活性较强；其中，化合物ACA-17和ACA-18对IMP-1的抑制活性均达到了 nM 级别。然后，我们研究并得到了部分化合物与 B1 类MBL的复合物晶体结构。以化合物ACA-2为例，VIM-2:ACA-2、NDM-1:ACA-2和IMP-1:ACA-2的复合物晶体结构揭示，化合物骨架ACA与Zn2配位并与L10 loop 上的 Arg228（VIM-2）/Lys224（NDM-1/IMP-1）形成静电相互作用，C2-氨基与Asp120形成了氢键相互作用。与碳青霉烯开环产物的复合物晶体结构对比，发现ACA-2与B1类MBL的结合模式与上文中开环产物的结合模式一致，验证了此类化合物设计理念的合理性。我们进行了最小抑菌浓度（MIC）实验，发现化合物ACA-1、ACA-3、ACA-5、ACA-7和ACA-15能够有效地增强美罗培南（简称MEM）的抗菌活性，尤其是针对大肠杆菌和肺炎克雷伯菌。在评价了化合物的安全性后，我们选择了化合物ACA-5.1（化合物ACA-5的钠盐形式）进行小鼠体内的药效学评价；结果显示，针对耐药菌（blaNDM-1）感染的脓毒症BABL/c小鼠模型，MEM（4 mg/kg）与化合物ACA-5.1（10 mg/kg）联合治疗使得小鼠在感染后7天后的生存率提升了50%，同时脏器内细菌载量均降低103左右，证明化合物ACA-5.1能够在体内有效地逆转细菌的碳青霉烯耐药性。<br>　　化合物ACA-5.1体外和体内药效学的有效性，充分证明了通过模拟碳青霉烯开环水解产物结合模式实现对MBL的抑制是可行的。但是上述化合物对B2和B3类MBL的抑制活性较差，而B2和B3类MBL同样具有重要的临床意义。我们进一步在化合物ACA-1的R2和R3位置进行修饰，获得了化合物ACA-19—ACA-36 ，最终提升了化合物的广谱抑制活性。其中化合物 ACA-36 抑制IMP-1、VIM-2、CphA、Sfh-I、L1和GOB-18的IC50值分别为2.21μM、0.43μM、9.11μM、10.12μM、3.48μM和3.65μM。VIM-2:ACA-24、L1:ACA-26、L1:ACA-27和Sfh-I:ACA-35的复合物晶体结构显示，化合物均是通过ACA骨架与Zn2配位，并与Asp120形成氢键；不同的是，L10 loop上与化合物相互作用的残基分别为Arg228（VIM-2）、Ser221/Ser225（L1）和Lys224（Sfh-I）。MIC结果显示化合物ACA-26、ACA-27、ACA-35和ACA-36均能恢复MEM对耐药菌的药效；值得一提的是，针对表达CphA和L1基因的MEM耐药工程菌株，ACA-35和ACA-36能够比Taniborbactam更有效地降低MEM的MIC值。<br>　　综上，本文通过对B1、B2和B3类MBL的底物偏好性、碳青霉烯及其开环水解产物与B1、B2和B3类MBL的结合模式研究，揭示了其共同关键结构特征，据此合理设计了一类以2-氨基噻唑-4-羧酸为母核的化合物；这些化合物表现出对B1、B2和B3类MBL的广谱抑制活性；复合物晶体结构揭示这些化合物模拟β-内酰胺开环水解产物作用于B1、B2和B3类MBL共同结构特征，如与Zn2配位、与锚定残基形成静电相互作用等。体内外药效学实验的有效性，有力地证明了此类化合物能够有效地逆转细菌对碳青霉烯的耐药性。因此，本文为广谱MBL抑制剂的研发提供了较好的先导化合物和重要结构基础。