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摘要背景和目的<br>　　全球范围内，每年因外科手术或意外受伤导致形成伤口和感染的患者数量高居不下，造成了术后住院时间的延长，住院率和病死率的提高，这对个人和社会都是很大的经济负担。急性伤口感染通常通过口服或肠胃外途径使用抗生素治疗，慢性细菌和真菌伤口感染大多使用含有抗生素或抗菌剂的局部乳膏、软膏、凝胶或洗液治疗。抗生素是目前治疗细菌感染的主要途径，但是抗生素的耐药性问题日渐凸显，减少抗生素的使用剂量和使用频率，寻求创新而高效的治疗方法是目前亟待解决的问题。在伤口自然连接处的表面，微生物会形成一种微生物网络，即生物膜。这种生物膜包裹在由多糖、蛋白质、核酸和脂质组成的水合胞外聚合物(EPS)的自合成基质中，这种生物膜对抗菌剂的抵抗力是浮游细菌的1000倍。通过传统方法施用抗菌剂来治疗皮肤伤口感染通常效率低下，大多数抗菌剂不善于消除生物膜，这种低效性可能是由于抗菌剂穿透EPS屏障的效率低下。真菌和细菌感染可以通过真皮和表皮层传递到皮下组织，由于常规药物透过角质层的渗透性较低，对深部皮肤感染无效，大多用于治疗浅表型感染，这导致不能完全消除感染源。<br>　　近些年，微纳加工技术制作的高度在10~1500µm，宽度在10~50µm的微针(MNs)，因其快速、高效、无痛的给药特点已经广泛用于药物、蛋白、基因、疫苗等生物大分子的传输和医学美容等领域。与常规的经皮给药系统、口服给药系统和注射给药系统相比，微针可以直接穿透皮肤的角质层实现药物的传输，并避免肝脏的首过效应；无须专业医护人员进行治疗，自我管理具有便利性，治疗具有无痛性，增强了患者的顺应性；无注射器的针管等尖端工具，消除了尖锐废物的产生，减少了医疗废物的回收处理和交叉感染的危险；储存、运输更加方便，降低了产品流通环节的成本。结合伤口感染的特点，微针是较优的应用于治疗伤口感染的药物传输载体，具有广泛的应用前景。按形态分类，微针可分为实心微针、涂层微针、空心微针、可溶解微针和水凝胶微针。透明质酸(HA)作为一种FDA批准使用的药用辅料，具有较好的皮肤刺入能力、生物相容性、无毒性，常用作水凝胶和微针的基质。壳聚糖(CS)是一种阳离子天然高分子聚合物，因其分子结构中带正电的氨基(-NH3+)易吸附呈负电的菌体，破坏细菌细胞的生理活性，从而具有良好的抗菌效果，其亲水性衍生物也曾作为微针的基质使用。从伤口中分离的病原株以金黄色葡萄球菌最多，大肠杆菌和肠道链球菌也是十分常见。金黄色葡萄球菌作为常见的伤口感染菌，会分泌产生明胶酶，而明胶超分子自组装形成的明胶纳米粒子(GNPs)遇明胶酶可快速解离。夫西地酸(FA)的抗菌活性早已得到证实，在伤口部位局部施用夫西地酸是可取的。<br>　　本文拟构建一种以透明质酸和壳聚糖为基质的微针，并装载包埋有夫西地酸的明胶纳米粒，通过明胶纳米粒响应性释放夫西地酸联合壳聚糖、透明质酸协同治疗感染性伤口，以达到高效抗菌、促进伤口愈合的效果。<br>　　方法<br>　　首先以两步去溶剂法制备明胶纳米粒，通过马尔文激光衍射粒度仪表征纳米粒的粒径大小和粒径分布，通过透射电镜(TEM)观察明胶纳米粒的形态结构，考察其稳定性。将夫西地酸包埋进明胶纳米粒形成FA-GNPs，通过紫外-可见分光光度计(UV-Vis)制定的标准曲线计算载药率和包封率，确定FA和GNPs的最佳投料比。采用与MMP-2共孵育的方法，考察将FA-GNPs的明胶酶响应性。<br>　　将HA、CS分别溶解，并将FA-GNPs溶解到CS溶液中。首先将CS溶液加至 PDMS 微针模具中，负压除气泡、高温烘烤浓缩形成微针针尖，再将 HA溶液加入模具进行烘烤形成微针基底，最终制备出FA-GNPs@CSamp;HA MNs微针体系。考察微针体系中纳米粒的溶出性，通过相机和扫描电镜(SEM)观察微针的形态结构，通过台盼蓝染色实验考察微针的皮肤刺入能力。<br>　　利用CCK-8实验法和活细胞染色法考察FA-GNPs@CSamp;HA MNs对L929细胞的毒性，评价其生物相容性。<br>　　建立金黄色葡萄球菌(S.aureus)感染的小鼠全层背部皮肤缺损模型，评价FA-GNPs@CSamp;HA MNs用于治疗皮肤感染伤口的效果，以生理盐水治疗组作为对照组，市售夫西地酸软膏治疗组、HA MNs治疗组、CS MNs治疗组和FA-GNPs@CSamp;HA MNs治疗组作为实验组。通过比较组间的伤口愈合情况来评价FA-GNPs@CSamp;HA MNs的皮肤修复效果，并通过组织病理学分析进一步验证。<br>　　结果<br>　　1. 成功合成了GNPs，初测平均粒径为167.50±1.89nm,平均分散指数（PDI）为0.001±0.027，GNPs的表面电荷由Zeta电位确定，测量值为−20.8±0.14mV；通过TEM观察发现，GNPs为分散均匀、大小均一的球体；将GNPs在室温下静置2天和在4℃连续储存14天，粒径大小和粒径分布均没有显著变化，该明胶纳米粒具有优良的稳定性；<br>　　2. FA/GNPs的投料比为1.5时，载药率为60.86%，包封率为96.19%，达到最佳效果；FA-GNPs 的酶解反应主要发生在 6~12h，酶解后的粒径减小至约80nm左右，证明该载药纳米粒具有良好的酶响应性；<br>　　3. 成功制备出具有完整形态结构的微针体系FA-GNPs@CSamp;HA MNs，微针大小为1cm×1cm，每片微针上有400(20×20)个排列齐整的针尖，每个针尖高500μm，底部宽200μm；FA-GNPs@CSamp;HA MNs中的纳米粒溶出后仍具有与游离态纳米粒相同的形态结构，且该微针具有优良的皮肤穿刺能力；<br>　　4. 通过细胞毒性实验和活死染色实验证明FA-GNPs@CSamp;HA MNs具有良好的生物相容性；<br>　　5. 成功建立了小鼠全层皮肤缺损感染模型，通过治疗小鼠全层皮肤缺损感染模型，计算伤口收缩率的结果显示FA-GNPs@CSamp;HA MNs治疗组的疗效优于其他各组，经 14 天治疗，伤口完全愈合；Hamp;E 染色切片的结果显示 FA-GNPs@CSamp;HA MNs治疗组的炎症反应更少，新生血管和成纤维细胞更多，促进皮肤修复的效果更好。<br>　　结论<br>　　本文构建了FA-GNPs@CSamp;HA MNs微针体系，该微针体系抗菌效果显著，有效促进了创面伤口的修复，还表现出优良的生物相容性。这种具备酶感应机制的智能抗菌贴剂，有效减少了抗生素的使用，具有闭环调节和预防抗生素耐药性的作用，与传统抗菌软膏、单一微针体系形成鲜明对比，协同治疗的高效性得到凸显，为感染性伤口的治疗和研究提供了思路和参考。