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摘要研究背景及目的<br>　　尿液中大量富集草酸盐成分是肾草酸钙结石形成最为明确的风险因素之一。尿液中草酸的主要来源是富含草酸的食物中摄入和机体新陈代谢产生。低草酸饮食有助于通过降低草酸排泄的途径，防止肾草酸钙结石的发展和进展，从而降低肾结石的风险。传统溶质过饱和析出理论认为高草酸尿会增加肾结石风险。除此之外，近年来越来越多的研究发现，高草酸盐环境对细胞损伤以及随后的炎症、细胞分化过程改变也起到了重要的作用。<br>　　上皮细胞在经历炎症、外界物理化学等刺激后，能够发生上皮细胞间质化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)的生物学表型变化。在EMT过程中，上皮细胞将表现出间充质细胞特征，如更少的细胞间连接、改变的细胞形状和分泌更多的细胞外基质。近年来许多研究表明，EMT可能在肾结石的发生和发展中起关键作用。间质化改变的肾小管上皮细胞极性减弱、细胞屏障作用降低，可能导致肾小管上皮局部对于微小钙盐结晶的清除能力降低，增加微小钙盐结晶与肾小管腔中粘附概率。同时，也有一些研究发现，与EMT启动密切相关的Twist1转录调控因子、EMT重要功能蛋白Clusterin(CLU)在肾结石患者的肾组织中大量表达。然而，EMT、Twist1与CLU三者之间的关系在肾结石中仍不清楚。因此，基于文献综述以及本团队前期研究基础，我们假设EMT过程中重要的Clusterin蛋白可能能够通过TGFβ1-Twist1-CLU信号转导途径参与高草酸尿增加肾草酸钙结石形成，并在此假设的基础上开展了本研究。<br>　　材料和方法<br>　　基于GEO公开Randall’s斑块转录组测序数据、大鼠建模肾脏样本转录组测序数据以及蛋白组测序数据的生物信息学研究。<br>　　1.人源Randall’s斑块转录组测序数据二次分析：通过下载GEO数据库中公开Randall’s斑块转录组测序数据(GSE73680)，基于R语言平台进行转录组数据清洗、整理、比较、KEGG/GO富集等步骤，使用GSEAV4.1.0软件进行GSEA分析，使用string数据库和Cytospace软件进行蛋白-蛋白互作网络分析，使用R语言平台完成相关性热图分析、单基因相关性分析、维恩分析等操作。<br>　　2.临床来源肾脏草酸钙结石样本蛋白组学分析：在完成临床伦理审批及知情同意的前提下，通过收集我院泌尿外科治疗的5例肾草酸钙结石样本，清洗、研磨、处理后进行SDS-PAGE胶电泳分层，再进行label-free质谱分析，所得到数据再同转录组测序数据进行联合分析。<br>　　3.基于SD大鼠肾脏草酸钙结石模型的转录组分析：使用百分之1体积比乙二醇喂养大鼠4周进行SD大鼠肾脏草酸钙结石建模，过量麻醉处死大鼠后收集肾脏标本，使用VonKossa钙盐染色法评估建模效果，评估建模成功后，使用液氮冻存样本提取大鼠肾脏总RNA，进行转录组测序，使用R语言平台完成清洗、整理、比较、KEGG/GO富集分析，使用GSEAV4.1.0软件进行GSEA分析，使用string数据库和Cytospace软件进行蛋白-蛋白互作网络分析，使用R语言平台完成相关性热图分析、单基因相关性分析、维恩分析。并将大鼠样本中转录组测序结果同人来源样本中转录组测序结果进行对比，进行大鼠模型分子生物学改变，同临床实际样本间的可比性评估。<br>　　经由TGFβ1-smad2/3-Twist1上调的尿液Clusterin蛋白和肾小管上皮细胞间质化改变参与肾草酸钙结石形成机制的实验室研究。<br>　　1.测序结果在模型中的表型验证：使用24小时高草酸盐培养基培养的方式建立高草酸尿损伤细胞体外模型；使用百分之1乙二醇4周喂养SD大鼠，构建高草酸尿致肾草酸钙结石动物体内模型。使用钙盐粘附法评估HK-2体外细胞建模效果，使用VonKossa染色等组织化学手段检测大鼠体内建模情况。使用蛋白免疫印迹法(Western Blotting, WB )、免疫组织化学法(immunohistochemistry, IHC)验证在生信分析中确定TGFβ1信号通路、EMT现象在细胞及动物模型中改变情况，以及CLU蛋白、Twist1蛋白在体内及体外模型中改变情况。<br>　　2.高草酸尿条件下，TGFβ1-smad2/3-Twist1-CLU信号通路的确定：首先使用核质分离法，确认在模拟高草酸尿液条件下TGFβ1信号通路经典途径的信号转导情况，再使用WB、免疫共沉淀法(Co-Immunoprecipitation, Co-IP)、染色质-蛋白免疫共沉淀法(Chromatin-immunoprecipitation，ChIP)、染色质下拉法(DNA pull down)检测在高草酸尿液环境下，特定分子信号通路的改变特征；使用DNApulldown、ChIP以及双荧光素酶报告基因试验法(dual-luciferase reporter assay)检测蛋白-染色质连接的功能性。使用发夹RNA(ShRNA)、小分子抑制剂等手段，敲低抑制经过上述试验过程确定的分子信号转导通路，明确信号转导与结石表型之间的因果性。<br>　　3.初步讨论Clusterin蛋白促进肾草酸钙结石生成的可能机制：使用晶体下拉法以及晶体形成下拉法(Crystal pull down，Crystal forming pull down)检测Clusterin蛋白同草酸钙晶体间的连接性。使用免疫共沉淀法拉取同CLU蛋白密切结合的其他蛋白质后，再使用非标记蛋白定量质谱法(label-free mass spectrum, LFMS)、转录组测序法(mRNA sequencing， mRNA-seq)确定同特定蛋白互作的其他蛋白，以期能够获得CLU蛋白参与肾草酸钙结石形成的其他可能途径。<br>　　研究结果<br>　　基于GEO公开Randall’s斑块转录组测序数据、大鼠建模肾脏样本转录组测序数据以及蛋白组测序数据的生物信息学研究。<br>　　1.在对GEO数据库中编号为GSE7368013的人类样本的mRNA测序数据进行整理、清洗和分析后，通过基因集富集分析(GSEA)分析，发现TGFβ1信号通路的激活和EMT过程的增强可能与肾草酸钙结石的形成密切相关。在相关热图分析中，注意到肾结石患者中TGFβ1信号通路与EMT过程之间的显著关联。在关键hub基因鉴定中，我们发现TGFβ1基因可能在肾结石形成中发挥重要作用。在显著差异基因(differentially expressed genes, DEGs)筛查阶段，发现了两个有趣的基因，Twist1和CLU，据广泛报道，它们与许多其他类型疾病的EMT过程相关。在进一步的线性相关分析中，发现在健康对照和肾结石患者中Twist1与CLU的表达均呈高度线性正相关。当使用无标记蛋白质谱法分析草酸钙结石标本时，发现CLU蛋白也是结石中显著富集的蛋白质之一。在进一步的加权共表达网络分析中(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)中，CLU也被鉴定为肾结石形成的重要基因。<br>　　2.在大鼠肾草酸钙结石模型肾脏样本的转录组测序分析中，发现其中变化的主要信号转导通路同人源样本中发生改变的信号通路类似，即主要发生了EMT过程和TGFβ1信号通路的激活，SD大鼠高草酸模型用于本课题研究是合理的。进一步的相关性分析也提示大鼠肾草酸钙结石模型肾脏中TGFβ1信号通路的激活与EMT过程之间存在不可忽视的关联。<br>　　经由TGFβ1-smad2/3-Twist1上调的尿液Clusterin蛋白和肾小管上皮细胞间质化改变参与肾草酸钙结石形成机制的研究。<br>　　1.首先，使用热图分析发现在肾草酸钙Randall’s样本中，两种经典的EMT相关蛋白E-cadherin和Vimentin是后续研究中的最佳蛋白标志物。<br>　　2.其次，在确定了拟检测的EMT相关标志物后，使用了不同浓度的24小时草酸钠处理HK-2细胞来模拟自然高草酸尿环境以建立体外研究模型。在使用WB对三种选定的生物标志物进行分析后，我们发现在完整培养基中的最终0.5mM草酸钠是本研究的最佳选择。使用钙盐粘附方法发现，在24小时高草酸干预后，更多的草酸钙一水合物晶体粘附在HK-2单层细胞之上。成功构建体外模型后，进一步使用蛋白检测手段发现了E-cadherin下调，Vimentin上调(提示了EMT过程显著上调)，也证实了TGFβ1-smad2/3信号通路在体外模型中显著激活。<br>　　3.然后，在大鼠肾草酸钙结石模型的体内实验中，使用钙盐染色法确定建模成功后，通过WB试验发现，TGFβ1信号通路同样呈现显著激活的状态，并且也在蛋白质水平上验证了EMT过程在动物体内模型中，呈现显著上调的情况。<br>　　4.在核质蛋白分离试验中，发现TGFβ1信号通路中经典Smad2/3分子的磷酸化比例增加、进入细胞核的易位量增加，同时也伴随着Twist1蛋白表达上调、核易位的增加。这一现象提示TGFβ1上调后，后续信号的转导可能依靠经典Smad2/3信号通路。为了进一步验证这一信号转导机制在高草酸盐模拟环境中情况，我们开展了后续定量免疫共沉淀试验，并发现在0.5mM草酸钠干预24小时后，实验组的磷酸化Smad2/3与Smad4结合显著增加。<br>　　5.紧接着，为了明确在高草酸盐刺激下HK-2细胞核内的转录过程改变，我们使用了生物素化DNA探针来检测Twist1和CLU基因启动子区域中磷酸化Smad2/3蛋白结合情况，以及Twist1蛋白与CLU基因发启动子区域的结合情况。发现转移到细胞核中的几个关键蛋白(P-Smad2/3)可以分别与Twist1和CLU基因的启动子区结合。在ChIP实验中，发现磷酸化Smad2/3蛋白分子可以与Twist1和CLU启动子区域中的特定染色质片段结合。Twist1蛋白还可以与CLU基因启动子区的特定染色质片段结合。通过定量分析发现，模型组中有更多的磷酸化Smad2/3蛋白结合到Twist1和CLU启动子区，更多的Twist1蛋白也结合到CLU启动区。在双荧光素酶报告基因测定中，发现过表达的Twist1蛋白可以与野生型CLU启动子区序列结合，并表达大量的荧光素，而在敲除CLU启动子区的特异性结合位点后，荧光素表达量显著降低。<br>　　6.以及，为了验证信号通路激活情况、关键蛋白同肾草酸钙结石表型之间的因果性，我们通过发夹RNA(short hairpin RNA, Sh-RNA)基因敲低试验和TGFβ1受体选择性小分子抑制剂进一步验证了TGFβ1信号通路、Twist1和CLU同草酸钙肾结石形成间的因果性。在敲低Twist1蛋白和CLU蛋白后，与简单建模组相比，Twist1和CLU的敲低可以显著降低一水草酸钙物晶体的粘附。同时，TGFβ1-Smad2/3信号通路的激活和EMT表型的变化符合实验预期。在使用TGFβ1受体选择性小分子抑制剂后，大鼠肾脏中的钙盐沉积量明显低于单纯模型组。同时TGFβ1信号通路的激活和EMT表型的变化仍与假设一致。<br>　　7.最后，为了进一步探究在尿液环境中，升高的CLU蛋白导致肾草酸钙结石形成的可能机制，我们开展了以下研究。首先使用ELISA检测了10名健康对照和10名草酸钙肾结石患者尿液中CLU蛋白浓度，发现两组之间存在显著差异。在晶体形成下拉实验中，发现添加重组CLU蛋白(Recombinant Clusterin, reCLU)蛋白后，草酸钙晶体的直径显著增加，进一步WB结果还表明，晶体直径的变化是由于CLU蛋白的添加导致的。成功在HK-2细胞中过表达CLU蛋白后，使用mRNA测序筛选差异基因。然后进行KEGG分子信号通路聚类，发现在过表达CLU蛋白的HK-2细胞中，收集肾小管中氢离子分泌的基因集被显著上调，对于其中重要的H+转运蛋白ATP6V1D和ATP6V1，使用WB进行蛋白质水平验证。为了进一步探讨导致收集导管酸分泌上调的可能机制，使用了Co-IP和MS分别检测空白对照HK-2细胞、0.5mM草酸钠处理的HK-2细胞和CLU过表达的HK-2的蛋白质相互作用。然而，最终的蛋白聚类结果相对隐晦，暂未得到明确的提示以供开展进一步研究。<br>　　结论<br>　　1.高草酸尿所导致的肾草酸钙结石与肾小管上皮细胞EMT过程密切相关；<br>　　2.Twist1蛋白是高草酸尿导致肾小管上皮细胞EMT过程中的核心转录调控因子；<br>　　3.CLU蛋白是由高草酸尿导致肾草酸钙结石过程中重要的功能蛋白；<br>　　4.TGFβ1-Twist1-CLU信号轴是高草酸尿导致肾草酸钙结石形成过程中关键的信号转导通路。