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摘要目的：<br>　　乳腺癌的单一治疗大多存在预后较差的问题。联合治疗是克服单一治疗局限性的常用策略，其中化疗联合光动力治疗是近年来兴起的有望进一步弥补单一治疗不足的联合治疗方式。然而，常用的化疗药物和光敏剂大多是小分子化合物，疏水性强、靶向性差、血液半衰期短、毒副作用大等问题严重影响了联合治疗的效果。纳米技术可在很大程度上改善小分子药物存在的局限性。天然多糖化合物来源广、成本低、生物相容性好，近年来作为载体材料用于递送抗肿瘤药物得到广泛的研究。然而，如何实现化疗药物与光敏剂的高效、可控共递送是目前亟待解决的难题。此外，纳米载体的组装性能、稳定性等理化性质与其在体内的生物分布以及治疗效果密切相关。因此，构建粒径大小合适、稳定性好的纳米粒子对提高协同治疗效果具有重要意义。<br>　　本文针对多糖类载体共递送化疗药物与光敏剂的过程中存在的比例调节难、组装效果不理想等问题，分别提出利用多糖分别偶联化疗药物与光敏剂，再将两种偶联物共组装的策略，以及通过可逆加成断裂链转移（Reversible addition-fragmentation chain transfer，RAFT）聚合对多糖进行修饰改性的研究策略。在本研究中，我们以具有血管内皮细胞高结合力的肝素钠（Heparin sodium，HP）或肝素-聚N-（2’-羟基）丙基甲基丙烯酰胺（HP-pHPMA）为载体，分别偶联化疗药物紫杉醇（Paclitaxel，PTX）和光敏剂焦脱镁叶绿酸a（Pyropheophorbide a，Ppa）。聚N-（2’-羟基）丙基甲基丙烯酰胺（pHPMA）是一种亲水性聚合物，具有生物相容性好、毒性低、制备简单等优点，考虑到pHPMA聚合物分子量会影响载体中 HP 的含量，可能会影响递送效率，我们构建三种不同分子量的HP-pHPMA药物偶联物，探究pHPMA分子量对递送效率的影响。此外，PTX通过ROS刺激响应的硫缩醛键与载体偶联，光动力产生的ROS一方面直接杀死肿瘤细胞，另一方面促进PTX释放，实现对小鼠乳腺癌的化疗协同光动力治疗。该研究为开发新型化疗药物与光敏剂共递送系统奠定了重要的研究基础，同时为多糖类给药系统的构建提供了新颖的研究思路。<br>　　材料和方法：<br>　　1.以肝素作为载体，通过缩合反应、点击反应等多步合成设计制备肝素药物偶联物HP-PTX和HP-Ppa。通过缩合反应以及无铜点击反应构建基于肝素的大分子链转移剂HP-CTA，并通过紫外分光光度计测试HP-CTA中CTA含量，通过红外检测HP-CTA中是否残留CTA-N3。以HPMA为单体，通过RAFT聚合制备不同分子量的HP-pHPMA聚合物（命名为HH）。最后通过点击反应制备不同分子量的药物偶联物HHx-PTX、HHx-Ppa（x=25 kDa、50 kDa、100 kDa）。<br>　　2.对所制备的HP-PTX、HP-Ppa、HHx-PTX、HHx-Ppa（x=25 kDa、50 kDa、100 kDa）聚合物通过核磁共振谱图（Nuclear magnetic resonance，NMR）、凝胶渗透色谱（Gel permeation chromatography，GPC）、高效液相色谱（High performance liquid chromatography ， HPLC ）、差式扫描量热法（ Differential scanning calorimetry，DSC）等进行结构表征和纯度分析。分别通过芘荧光法和动态光散射仪（Dynamic light scattering，DLS）测定HP-PTX、HP-Ppa、HHx-PTX、HHx-Ppa（x=25 kDa、50 kDa、100 kDa）的临界聚集浓度和粒径分布。<br>　　3.基于Ppa自身的荧光特性，利用小动物活体成像仪考察HP及HH类聚合物的体内分布与滞留情况，探究pHPMA分子量对递送效率的影响，筛选具有长肿瘤聚集时间的聚合物进行共组装研究。通过 DLS 研究不同比例的 PTX与Ppa聚合前药共组装体的粒径分布。分别通过透射电子显微镜（Transmission electron microscope，TEM）和DLS观察HP-PTX、HP-Ppa、HH25k-PTX、HH25k-Ppa、及各自的共组装体HP-PP和HH-PP的微观形貌和体外稳定性。通过紫外分光光度计和荧光分光光度计表征HP-Ppa、HP-PP、HH25k-Ppa、HH-PP的光谱 学性质和组装性能。利用单线态氧检测试剂盒（Singlet oxygen sensor green， SOSG）测试HP-Ppa、HP-PP、HH25k-Ppa、HH-PP的活性氧产生能力。在660 nm激光照射下通过酶标仪测试HP-Ppa、HP-PP、HH25k-Ppa、HH-PP光稳定性质。通过HPLC和DLS考察HP-PTX的活性氧响应性能及药物释放行为。<br>　　4.对HP-PTX进行5-羧基-X-罗丹明（5-Carboxy-X-rhodamine，Rox）荧光标记，并命名为HP-PTX-Rox，共组装体命名为HP-PP-Rox。通过Ppa和Rox的荧光信号在小动物活体成像实验中观察HP-PTX-Rox、HP-Ppa、HP-PP-Rox在4T1 荷瘤裸鼠中的分布情况。并进行离体成像及荧光信号的半定量分析。收集肿瘤组织进行切片荧光分析。<br>　　5.在体外抗肿瘤研究中，通过CCK-8试剂盒研究HP-PTX、HP-Ppa以及不同比例共组装体HP-PP对小鼠乳腺癌4T1细胞的毒性，计算不同比例共组装体HP-PP的联合指数。通过激光共聚焦显微镜检测HP-PTX-Rox、HP-Ppa、HP-PP-Rox在4T1细胞的摄取情况。通过2-脱氧-D-葡萄糖（2-Deoxy-d-glucose）、渥曼青霉素（Wortmannin）、甲基-β-环糊精（Methyl-β-cyclodextrin）、染料木素（Genistein）等内吞抑制剂或将细胞置于4℃条件培养，确定4T1细胞对HP-PP的摄取途径。通过亚细胞器定位考察HP-PTX-Rox、HP-Ppa以及HP-PP-Rox在细胞中的富集位置；利用DCFH-DA荧光探针测试HP-Ppa、HP-PP处理、辐照后4T1细胞ROS生成；利用凋亡试剂盒探索HP-PTX、HP-Ppa以及HP-PP引起 4T1 细胞凋亡情况；通过微丝微管进行染色研究 HP-Ppa、HP-PTX 以及HP-PP对4T1细胞微丝微管的作用效果。<br>　　6.以健康小鼠为实验对象，考察 HP-PTX、HP-Ppa 以及 HP-PP 的毒副作用，观察给药后小鼠的体重变化和行为是否异常。实验结束后眼球取血进行全血计数以及血液生化分析，取小鼠心、肝、脾、肺、肾进行苏木精-伊红（Hamp;E）染色，分析HP-PTX、HP-Ppa和HP-PP对小鼠器官的影响。通过4T1荷瘤小鼠评估HP-PTX、HP-Ppa和HP-PP的抗肿瘤效果。记录给药后小鼠肿瘤体积和体重变化，实验结束后取血进行全血计数以及血液生化分析。收集主要脏器和肿瘤并进行称重，计算脏器系数以及肿瘤质量/体重比；通过肿瘤重量计算抑瘤率（TGI，%）；通过免疫组化分析抗肿瘤机理。<br>　　结果：<br>　　1．HP-PTX和HP-Ppa的核磁谱图中PTX和Ppa特征峰的出现表明成功制备了肝素-药物偶联物。HPLC分析结果表明HP-PTX和HP-Ppa不含小分子化合物。DSC结果表明HP-PTX和HP-Ppa为化学偶联得到的产物，而非共混形式。紫外光谱图显示HP-CTA中CTA含量为9%，表明每一个肝素分子中含有2.09个CTA。核磁谱图表明成功制备了HP-pHPMA聚合物。GPC谱图变化以及分子量统计结果显示成功制备了三种不同分子量的 HP-pHPMA 化合物，命名为HH25k，HH50k，HH100k。通过点击反应合成最终产物，核磁谱图中出现PTX的特征峰表明HHx与具有ROS响应活性的Mal-TA-CA-PTX成功偶联。<br>　　2．通过芘荧光法测得HP-PTX、HP-Ppa、HH25k-PTX、HH25k-Ppa、HH50k-PTX、HH50k-Ppa、HH100k-PTX、HH100k-Ppa的临界聚集浓度分别为1.77、9.69、12.23、3.69、22.17、4.45、6.27、7.67μg/mL，DLS结果表明它们的水相粒径均在50-200 nm之间。<br>　　3．活体成像结果表明与HH50k-Ppa、HH100k-Ppa相比，HP-Ppa和HH25k-Ppa具有更长的肿瘤聚集时间和更强的肿瘤聚集能力，且 HP-Ppa 在肿瘤组织处滞留时间更长。因此选择HP-Ppa和HH25k-Ppa分别与HP-PTX和HH25k-PTX共组装。DLS结果表明HP-PTX/HP-Ppa=2/1和HH25k-PTX/HH25k-Ppa=1/1具有较优的粒径分布，将两者分别命名为 HP-PP 和 HH-PP。TEM 显示 HP-PTX、HP-Ppa、HP-PP均呈单一的球状结构，HH25k-Ppa的形貌为棒状，HH25k-PTX为不规则球状，共组装体 HH-PP 为单一的球状形貌。稳定性测试实验结果表明HP-Ppa在水相介质中稳定性较差，而HP-PTX和HP-PP在不同介质中均具有较好的稳定性；HH25k-Ppa、HH25k-PTX 以及 HH-PP 在不同介质中均具有较好的稳定性。光谱学结果表明共价偶联不影响Ppa的特征峰，HP-Ppa、HP-PP、HH25k-Ppa和HH-PP在PBS中均处于组装状态。光稳定实验表明共组装策略增加了 Ppa 在激光辐照下的稳定性。体外单线态氧产率检测结果显示 HP-Ppa、HP-PP的活性氧产生能力显著高于HH25k-Ppa和HH-PP。体外响应性能测试结果表明HP-PTX对多种ROS具有刺激响应能力，且与ROS的浓度以及孵育时间相关。<br>　　4．体内分布实验显示尾静脉给药72 h后HP-PP-Rox在肿瘤部位的荧光强度是游离Ppa的11倍，表明HP-PP-Rox具有长循环特性。相比于HP-Ppa，HP-PP-Rox增加了在肿瘤部位的聚集，而相比于HP-PTX-Rox，HP-PP-Rox减少了在肝脏部位的分布。<br>　　5．CCK-8实验结果表明不同比例的HP-PP的细胞毒性均大于HP-PTX或HP-Ppa。通过IC50值计算联合指数，结果显示HP-PTX/HP-Ppa=2/1时联合指数在细胞死亡率为15%-90%范围内均小于0.6。摄取途径研究结果表明HP-PP主要通过小窝蛋白介导的内吞作用进入4T1细胞。亚细胞器定位实验表明HP-PP-Rox分布在多个细胞器中。胞内ROS实验显示HP-Ppa和HP-PP具有较强的产生ROS的能力。通过Annexin V-FITC/PI双染色法进行细胞凋亡检测发现辐照后HP-PP的晚期凋亡细胞率为42.16%，显著高于HP-PTX和HP-Ppa。微丝微管实验结果表明HP-PTX和HP-PP均具有稳定微丝微管的作用。<br>　　6．在毒副作用考察中，HP-PTX、HP-Ppa、HP-PP均对小鼠没有明显的毒副作用，主要体现在体重变化、血常规、血液生化结果以及主要器官的Hamp;E染色结果中。体内抗肿瘤实验结果表明HP-PP具有更好的抗肿瘤效果，HP-PP治疗组肿瘤体积最小、肿瘤重量最轻。HP-PP 抑瘤率高达 98.1%。荷瘤小鼠的血常规结果显示HP-Ppa和HP-PP组小鼠的白细胞（White blood cells，WBC）量及其相关指数与正常小鼠持平，而其它治疗组小鼠显著高于健康小鼠。免疫组化结果表明HP-PTX、HP-Ppa以及HP-PP均可诱导细胞凋亡，而HP-PP通过抑制肿瘤细胞增殖及血管生成进一步抑制肿瘤生长。<br>　　结论：<br>　　针对乳腺癌单一治疗效果不理想，化疗与光动力联合治疗时药物水溶性差、毒副作用大、共递送难，多糖类给药系统组装性能差等问题，本研究以肝素为载体，分别构建了 HP-PP 和 HH-PP 两个给药系统，实现了化疗药物和光敏剂分子给药比例的可控调节以及共递送。高效递送至肿瘤组织后，Ppa在660 nm激光照射下产生大量ROS，直接有效杀伤肿瘤细胞；与此同时，ROS进一步促进PTX释放，实现化疗联合光动力高效抗小鼠乳腺癌的治疗。<br>　　1.经pHPMA修饰肝素，随着pHPMA分子量的增加，肝素占比减少，载体在小鼠肿瘤滞留时间变短，揭示肝素在循环及肿瘤靶向中起主导作用。<br>　　2.共组装方式构建的递送系统 HP-PP 和 HH-PP 具有更优的组装性能、体外稳定性及光稳定性，为实现体内外高效抗肿瘤效果奠定了基础。<br>　　3.HP-PP在体外展现出更强的细胞毒性以及促细胞凋亡的能力，同时在体内也具有更强的抗肿瘤效果及低的毒副作用。<br>　　综上所述，我们构建了基于肝素的ROS响应型肝素-药物偶联物以及肝素-pHPMA-药物偶联物，通过分别偶联PTX与Ppa，再将两种偶联物共组装成一个纳米递送系统，实现了PTX和Ppa比例的灵活调节，制备得到了组装稳定的纳米聚集体，克服了化疗药物与光敏剂共递送难的问题，达到了化疗与光动力协同高效抗乳腺癌的目的。