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摘要目的：<br>　　免疫治疗中的免疫检查点抑制剂(Immune checkpoint inhibitors, ICIs)疗法，如抗PD-L1抗体通过阻断与PD-1受体间的免疫逃逸通路，具有抑制肿瘤转移和复发的治疗效果。然而，ICIs在患者中的响应率仅为10-30%，这主要是由于肿瘤免疫原性低和肿瘤内CD8+T细胞浸润较少，处于免疫抑制状态导致的。提高ICIs在肿瘤患者中的响应率，使其受益于更多患者，是肿瘤免疫治疗研究中的热点问题。研究表明，蒽环类化疗药物如表阿霉素(Epirubicin, EPI)等在杀伤肿瘤细胞的同时还可以诱导免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death, ICD)，释放肿瘤相关抗原(Tumor associated antigen, TAA)和损伤相关分子模式(Damage-associated molecular patterns, DAMPs)，增强肿瘤部位的抗原性和佐剂性，使死亡肿瘤细胞由非免疫原性转变为免疫原性。同时释放的TAA和DAMPs激活“肿瘤-免疫”循环，促进抗原提呈细胞的激活和成熟，增加CD8+T细胞浸润至肿瘤部位，发挥特异性的肿瘤细胞杀伤作用。因此，通过在肿瘤部位诱导ICD，增强肿瘤的免疫原性，活化肿瘤免疫微环境，进而增效抗PD-L1抗体免疫治疗，是一种极具潜力的策略。<br>　　为了实现在肿瘤部位高效地诱导ICD，越来越多的纳米递药系统被用于ICD诱导剂的高效递送。其中，通过在纳米粒外包被一层细胞膜构建的纳米递药系统显示出更多的优势。一方面其保留了传统纳米粒固有的小尺寸、高效递送的特征；另一方面还保留了细胞膜的生物学功能，如同源靶向作用等。同时，细胞膜还可以通过功能化改造实现对递药系统多元功能化的设计，是一种较理想的药物递送载体。因此，开发基于细胞膜功能化纳米递药系统可以实现细胞膜生物学功能与工程性纳米粒功能的有机整合，有望在肿瘤部位高效地诱导ICD效应。<br>　　基于上述科学问题和研究基础，本研究拟通过构建基于肿瘤细胞膜功能化纳米递药系统递送EPI诱导ICD，激活“肿瘤-免疫”循环，增加肿瘤内CD8+T细胞的浸润，提高抗PD-L1抗体的响应率，实现高效抗肿瘤免疫治疗的目的。我们对该纳米递药系统中外层细胞膜和内核纳米粒的功能性上进行了探索与提升，通过对肿瘤细胞膜和钙网蛋白(Calreticulin, CRT)过表达肿瘤细胞膜生物学功能的研究，实现了纳米递药系统外层细胞膜功能的提升；通过构建级联“自放大”作用的纳米粒强化肿瘤部位的ICD效应，实现了纳米递药系统中内核功能性纳米粒的构建。以及对肿瘤细胞膜包被的纳米递药系统诱导ICD能力和增效抗PD-L1抗体免疫治疗的机制进行了探索。本研究有望为基于肿瘤细胞膜的纳米递药系统增强肿瘤免疫治疗提供重要参考。<br>　　材料和方法：<br>　　本研究首先构建了4T1细胞膜包被的纳米粒，探索了通过同源靶向递送EPI至肿瘤部位诱导ICD效应的可行性。通过体外培养小鼠乳腺癌细胞4T1，采用超高速离心方法收集细胞膜。以可逆加成-断裂链转移(Reversible addition-fragmentation chain transfer, RAFT)聚合和点击反应为基础制备了偶联EPI的支化聚乳糖聚合物前药B-PLAE4，通过超声处理法制备4T1细胞膜包裹的纳米递药系统mB-PLAE4。通过体外细胞摄取和体内小动物活体成像实验考察mB-PLAE4的同源靶向能力；以小鼠4T1乳腺癌为肿瘤模型考察抗肿瘤治疗效果。<br>　　为了进一步提升肿瘤部位的免疫原性和CD8+T细胞的浸润比例，我们对细胞膜包被的纳米递药系统进行了二元功能性的设计。对于外层细胞膜，通过EPI预处理4T1细胞，采用超高速离心方法收集得到CRT-过表达的4T1细胞膜。通过蛋白免疫印迹(Western blot, WB)验证CRT蛋白的过表达。CRT-过表达的4T1细胞膜与免疫细胞RAW264.7和小鼠骨髓来源树突状细胞(Bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)共培养考察CRT-过表达细胞膜的免疫刺激作用。对于内核纳米粒，采用“一锅法”制备了负载EPI、氯高铁血红素(Hemin )和葡糖氧化酶(Glucose oxidase, Gox )的“自放大”功能性纳米粒EHGZ。通过增加细胞内活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的生成和下调谷胱甘肽(Glutathione, GSH)含量进一步放大单独EPI诱导的ICD效应。采用超声处理法制备CRT-过表达4T1细胞膜包被的纳米递药系统(mEHGZ)。通过布鲁克海文zeta电位及激光粒度分析仪、透射电镜(Transmission electron microscope, TEM)和元素扫描分析考察包膜纳米递药系统的理化性质。通过纳米流式分析法对包膜纳米粒的比例进行定量分析。通过体外pH5.4和pH7.4缓冲液中释放行为的研究考察EHGZ和mEHGZ酸响应释药的特性。<br>　　以小鼠乳腺癌细胞4T1为模型细胞，研究了mEHGZ的体外细胞学行为。通过激光共聚焦显微镜和流式检测分析了mEHGZ在4T1细胞上的摄取行为和摄取途径；通过CCK-8试剂盒和AnnexinⅤ凋亡检测试剂盒考察mEHGZ的细胞毒性；通过DCFH-DA探针检测mEHGZ在细胞内生成ROS的能力以及还原性谷胱甘肽检测试剂盒测定不同处理后细胞内GSH的含量；通过免疫荧光实验和ATP检测试剂盒检测CRT暴露、HMGB1释放和ATP分泌的情况，考察mEHGZ诱导4T1细胞发生ICD的能力；通过建立Transwell体外共培养体系，考察mEHGZ诱导ICD后刺激BMDC成熟的能力。<br>　　建立小鼠4T1乳腺癌皮下瘤模型，考察了mEHGZ在体内生成ROS、下调GSH和在肿瘤部位诱导ICD的能力，接着考察了mEHGZ联合抗PD-L1抗体的抗肿瘤效果。为了探索mEHGZ的抗肿瘤特性，我们还建立了小鼠CT26结肠癌皮下瘤模型，考察mEHGZ的抗肿瘤效果。<br>　　为了研究mEHGZ增效抗PD-L1抗体疗效的机制，采用流式细胞仪分析了治疗后小鼠机体内免疫激活的情况。在mEHGZ治疗结束后第二天，取淋巴结、脾和肿瘤组织制备细胞悬液，流式抗体染色后流式分析树突细胞(Dendritic cell, DC)成熟比例、CD8+T细胞比例、IFN-γ+-CD8+T细胞比例。同时通过酶联免疫吸附实验(Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)检测了肿瘤组织上清液中细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的含量。<br>　　结果：<br>　　对于4T1细胞膜包被的纳米粒，超高速离心收集4T1细胞膜，以RAFT聚合为基础合成支化聚乳糖聚合物B-PLAE4，核磁共振氢谱表征所合成聚合物结构的正确性。通过超声处理法制备得到包膜纳米粒mB-PLAE4，粒径为124.73±1.72nm，zeta电位为-24.86±0.99mV，同时TEM图像表明细胞膜包裹在纳米粒的最外层，厚度约为12nm。体外细胞摄取表明mB-PLAE4的摄取效率比B-PLAE4高1.21倍，小动物活体成像表明mB-PLAE4高效聚集在肿瘤部位，实现同源靶向递送。体内抗肿瘤实验表明mB-PLAE4能够诱导ICD效应，增强抗PD-L1抗体对肿瘤生长的抑制作用。<br>　　对于功能性CRT-过表达4T1细胞膜包被的纳米递药系统，首先4T1细胞在经过EPI预处理后，采用超高速离心法收集得到了CRT-过表达的4T1细胞膜。与相同浓度的4T1细胞膜相比，CRT-过表达4T1细胞膜与RAW264.7和BMDC共培养后CD80阳性细胞比例分别是4T1细胞膜组的2.09倍和1.47倍，表明CRT-过表达的4T1细胞膜具有一定的免疫刺激作用，能够促进抗原提呈细胞的成熟。其次，通过“一锅法”成功制备了包载ICD诱导剂EPI、Hemin和Gox的EHGZ纳米粒，粒径为123.66±2.83nm，zeta电位为17.77±0.96mV。随后，采用超声处理后得到包被细胞膜的纳米递药系统mEHGZ，粒径为133.92±2.70nm，zeta电位为-26.47±1.98mV。在TEM图像下，可以看到纳米粒的表面有一层厚度为10nm的细胞膜存在，EDSmapping元素分析可以看到细胞膜特征元素—磷元素的存在，佐证了细胞膜的成功包裹。从纳米流式定量结果可以看出，细胞膜包裹的效率为21.0%。接下来，体外稳定性研究表明mEHGZ在72h内粒径和PDI基本保持一致，具有一定的稳定性。体外释放行为的考察结果表明制备的纳米递药系统mEHGZ能够实现肿瘤弱酸环境下的响应性释药。<br>　　体外细胞摄取实验结果显示mEHGZ在同源细胞4T1细胞上的摄取效率为92.04%±1.87%，非同源细胞293T、RAW264.7和HUVEC细胞上的摄取效率分别为20.95%±0.43%、14.45%±1.66%和28.18%±1.21%，可以看出包裹细胞膜可以增强纳米粒的同源识别能力。在细胞摄取途径实验中，经过4℃和网格蛋白抑制剂氯丙嗪处理后4T1细胞对mEHGZ的摄取效率分别下降了57.98%和61.31%，表明mEHGZ主要通过能量依赖和网格蛋白介导的途径进入4T1细胞内。体外4T1细胞毒性实验结果表明，mEHGZ处理后细胞凋亡比例从游离EPI组的19.02%±1.16%增长至88.41%±2.98%，表明mEHGZ能够有效的杀死4T1细胞。体外4T1细胞与mEHGZ共孵育后，能够促进CRT从内质网迁移至细胞膜表面，促进HMGB1释放至细胞外，促进ATP的分泌，表明mEHGZ可以有效地诱导4T1细胞发生ICD。接着，我们分析了mEHGZ能够诱导更强大ICD的原因，DCFH-DA探针检测结果表明mEHGZ可以促进4T1细胞内ROS的生成，同时4T1细胞内GSH的含量与对照组相比下降了45.39%。这表明mEHGZ在细胞内通过增加ROS生成和下调GSH介导基于ROS的内质网应激，加强了诱导4T1细胞发生ICD的能力。体外Transwell共培养实验表明，mEHGZ处理后4T1细胞能够明显促进BMDC的成熟，成熟比例从11.12%±2.09%(EPI组)增长至33.30%±1.27%(mEHGZ组)。<br>　　体内抗小鼠4T1乳腺癌结果显示：单独抗PD-L1抗体的抑瘤率为36.92%，mEHGZ治疗组的抑瘤率为69.54%，而联合mEHGZ和抗PD-L1抗体治疗组的抑瘤率为82.02%；可以看出联合mEHGZ和抗PD-L1抗体治疗显著提高了小鼠4T1乳腺癌的抑瘤率。同时从治疗周期结束后小鼠肺部苏木素-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining, Hamp;E)切片结果可以看出，联合治疗组能够有效的抑制肿瘤的肺部转移。在基于mEHGZ联合抗PD-L1抗体显示出优异的抗肿瘤效果，我们继续考察了mEHGZ对小鼠CT26结肠癌的治疗效果，结果显示治疗周期结束后EPI治疗组肿瘤重量为1020.34±254.72mg，而mEHGZ联合抗PD-L1抗体治疗组肿瘤重量为88.44±47.50mg，可以看出联合治疗组对小鼠结肠癌有显著的抑制肿瘤生长的抗肿瘤治疗作用。<br>　　对于mEHGZ诱导ICD增效抗PD-L1抗体治疗效果的机制研究，结束治疗后的4T1乳腺癌荷瘤小鼠体内免疫细胞分析结果显示：mEHGZ治疗后淋巴结内CD8+T细胞的比例是抗PD-L1抗体治疗组的1.37倍，脾内CD8+T细胞的比例是抗PD-L1抗体治疗组的1.71倍，表明mEHGZ有效激活了小鼠体内的免疫应答，促进了CD8+T细胞的分化。肿瘤内免疫细胞的分析结果显示，mEHGZ治疗后肿瘤内DC成熟比例是EPI治疗组的1.82倍，是抗PD-L1抗体治疗组的1.89倍，表明mEHGZ诱导ICD释放的TAA和DAMPs有效地吸引了抗原提呈细胞到肿瘤部位提呈处理TAA。mEHGZ治疗组肿瘤内CD8+T细胞的浸润比例是抗PD-L1抗体治疗组的11.55倍，表明mEHGZ治疗高效地增加了CD8+T细胞的浸润。同时mEHGZ治疗组IFN-γ+-CD8+T细胞的比例是抗PD-L1抗体治疗组的7.36倍。此外，mEHGZ治疗组肿瘤免疫微环境内炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的浓度是单独抗PD-L1治疗组的1.55倍、1.28倍和2.56倍，表明mEHGZ介导ICD后促进免疫细胞浸润至肿瘤内，增加了炎性细胞因子的分泌，创造了免疫活化的微环境。<br>　　结论：<br>　　在本研究中基于ICIs如抗PD-L1抗体在肿瘤免疫治疗中响应率低的难题，构建细胞膜功能化纳米递药系统，提出在肿瘤部位诱导ICD，激活“肿瘤-免疫”循环，增效抗PD-L1抗体免疫治疗效率的策略。通过构建4T1细胞膜包裹的纳米粒表明肿瘤细胞膜包裹的纳米递药系统能够实现同源靶向递送的目的，EPI诱导ICD可以增加肿瘤内CD8+T细胞的比例，联合抗PD-L1抗体治疗后能够有效抑制小鼠4T1乳腺癌的生长。紧接着，我们创新性的通过外层细胞膜的功能化设计和内核纳米粒介导级联反应放大ICD，构建了功能性二合一的纳米递药系统。我们选用具有免疫刺激作用的CRT-过表达的4T1细胞膜包裹负载了EPI、Gox和Hemin的ZIF-8纳米粒。一方面CRT-过表达的4T1细胞膜具有佐剂作用，促进BMDC的成熟；另一方面通过增加细胞内ROS的生成和下调GSH能够有效地放大EPI的ICD效应。二者有效统一，上调抗原性和佐剂性进一步加强了肿瘤部位的免疫原性，有效地激活小鼠机体的免疫应答，增加肿瘤内DC的成熟和CD8+T细胞的浸润比例，促进炎性细胞因子IFN-γ、TNF-α和IL-6的分泌。将免疫抑制的肿瘤微环境活化为免疫响应的微环境，从而提高抗PD-L1抗体的响应率，显著抑制了小鼠4T1乳腺癌的生长并有效抑制了肿瘤的肺部转移。基于上述结果，本研究中从4T1细胞膜到CRT-过表达的4T1细胞膜实现了纳米递药系统外层细胞膜生物学功能化的升级，从化疗药物EPI到级联“自放大”ICD效应实现了纳米递药系统内核纳米药物功效的提升。该课题构建的肿瘤细胞膜包被的纳米递药系统通过诱导ICD，有效提高了抗PD-L1抗体的治疗效率，为增强肿瘤的免疫治疗效果提供了一种新的思路。