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摘要目的：<br>　　痤疮是一种主要累及面部毛囊皮脂腺单位的慢性炎症性皮肤病，已经成为全球第八大常见病，好发于青春期。由于痤疮好发于面部，中重度痤疮患者若不能及时有效地治疗易形成色沉和痤疮瘢痕，给患者带来容貌焦虑和心理负担。毛囊皮脂腺导管角化异常、炎症和免疫反应、皮脂腺分泌增多以及痤疮丙酸杆菌定植与感染是痤疮的四大主要发病原因，其中，炎症几乎贯穿于痤疮发病的始终，有效控制炎症是控制痤疮的重要环节。丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase，MAPK)和核因子-κB(Nuclearfactor-κB，NF-κB)信号通路在痤疮炎症中发挥着重要作用。目前治疗痤疮的传统药物中，抗生素类和维A酸类均发挥了确切疗效，但由于系统用药疗程长、副作用较大、容易产生耐药性等，部分患者依从性差，从而影响了对痤疮的治疗效果。因此，开发更加安全有效的抗痤疮新药具有十分重要的临床意义。<br>　　硫化氢(H2S)是继一氧化碳(CO)和一氧化氮(NO)之后在哺乳动物体系中发现的第三种气体信号分子，可在短时间内自由跨膜扩散，转导细胞信号，在多种组织器官中发挥着抗炎、抗氧化、调节脂质平衡、抑菌等功效。近年来H2S已成为新药研究与开发的热点，众多H2S供体的新型药物已经被成功合成并投入基础及临床试验。其中，将H2S供体与现有药物接合得到的新化合物既能发挥H2S的功效，又具有原药物的药理活性，具有协同作用。<br>　　水杨酸是一种存在于自然界中的β-羟基酸，在痤疮和其他皮肤病治疗中得到了广泛的应用，具有杀菌、抑菌、抗炎、减少皮脂分泌和双向调节角质的作用，同时，它能够抑制表皮神经冲动释放，发挥止痒功效。<br>　　由于H2S及水杨酸单体在临床上的单独应用都存在着部分缺陷，本研究将H2S供体与水杨酸通过羧合反应相结合，合成了一种新化合物即硫化氢水杨酸接合物(HS-SA)，探究其对痤疮的作用及机制，为后期开发具有痤疮治疗效果的新药提供理论依据。<br>　　材料和方法：<br>　　1.HS-SA的制备与表征<br>　　加入化合物茴三硫(ADT )、吡啶盐酸盐和盐酸得到产物去甲茴三硫(ADT-OH)，即H2S的供体。ADT-OH和水杨酸(SA)经羧合反应得到终产物硫化氢水杨酸接合物(HS-SA)。通过核磁共振氢谱、碳谱和质谱表征确认。<br>　　2.HS-SA对角质细胞和皮脂腺细胞增殖、凋亡的影响<br>　　不同浓度(0、5、10、20、40、50、100μM)HS-SA溶液处理人角质形成细胞系HacaT、人皮脂腺细胞系SZ95和原代人皮脂腺细胞24小时，CCK-8检测细胞增殖活力，流式细胞术检测细胞凋亡情况。<br>　　3.HS-SA对角质细胞和皮脂腺细胞炎症的影响<br>　　肿瘤坏死因子α(TNF-α)分别干预HacaT细胞和SZ95细胞0、6、12、24h，荧光定量聚合酶链式反应(qPCR)检测促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的表达量。热灭活痤疮丙酸杆菌(C.acnes)分别干预HaCaT细胞和SZ95细胞0、3、6、12、24h，qPCR检测促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的表达量。用TNF-α和C.acnes分别刺激HaCaT细胞和SZ95细胞构建炎症模型，加入HS-SA、ADT-OH、SA和地塞米松(DEX)预处理，qPCR检测TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的表达量，ELISA检测IL-6的含量。免疫荧光检测细胞内活性氧(ROS)水平。<br>　　4.HS-SA对兔耳痤疮样皮肤炎症的影响<br>　　选择新西兰雄性白兔作为实验动物，将28只12周龄实验兔随机分为正常对照组、模型组、基质组、1%HS-SA组、1%ADT-OH组、1%SA组和0.025%维A酸组，每组4只。除正常对照组外，其余各组煤焦油涂抹兔双耳内侧，每日一次，连续两周。从涂抹第五天开始，在涂抹煤焦油后，兔耳皮下注射C.acnes菌液50μL/每单耳，隔日一次，直至造模结束。随后，在造模处分别外用对应药物，每日一次，连续两周。通过肉眼观察和拍照统计用药后毛囊口的大小、丘疹个数等变化，HE染色观察皮肤厚度、炎细胞等病理学改变，免疫组化染色检测炎症相关因子IL-1β、TNF-α、COX-2、NF-κBP65和IκBα的表达量变化。<br>　　5.HS-SA对皮脂腺细胞脂质产生的影响<br>　　亚油酸(LA)干预人皮脂腺细胞系SZ95和原代人皮脂腺细胞作为诱导细胞脂滴增多模型，分别加入HS-SA、ADT-OH和SA共同干预细胞48h，尼罗红染色和油红染色观察细胞内脂滴的变化，qPCR检测脂质合成相关基因固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)的表达量变化，酶标仪比色法检测皮脂腺细胞内甘油三酯的含量。<br>　　6.HS-SA对痤疮相关致病菌生长的影响<br>　　不同浓度(0-156.25μg/mL)的HS-SA、ADT-OH和SA分别与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌共培养13或24h，每小时测定600nm处吸光度并绘制生长曲线；HS-SA、ADT-OH和SA分别与金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌共培养24h或72h，接种至固体培养基培养，菌落形成单位计数(CFU)法统计比较菌落个数。<br>　　7.HS-SA抗炎机制的探究<br>　　设置正常对照组、C.acnes组、HS-SA+C.acnes组，干预HaCaT细胞12h，进行转录组测序，对差异基因及参与的调节通路进行分析。WesternBlot和免疫荧光对MAPK通路和NF-κB通路进行验证，qPCR检测P38MAPK通路抑制剂、NF-κB通路抑制剂处理细胞后促炎因子表达的变化。<br>　　结果：<br>　　1.HS-SA的制备与表征<br>　　反应得到终产物HS-SA为橘黄色固体粉末。经核磁共振氢谱、碳谱和质谱分析与目标化合物结构式相符。<br>　　2.HS-SA对角质细胞和皮脂腺细胞增殖、凋亡的影响<br>　　HS-SA干预细胞24h可以抑制人角质形成细胞系HaCaT、人皮脂腺细胞系SZ95和原代人皮脂腺细胞增殖，且具有浓度依赖性，细胞形态未见明显改变，50μM的HS-SA、ADT-OH、SA干预细胞可以诱导细胞凋亡，在HaCaT和SZ95细胞中，同等浓度的HS-SA比SA诱导细胞凋亡的能力更强(Plt;0.05)；在原代皮脂腺细胞中，同等浓度的HS-SA比ADT-OH和SA诱导细胞凋亡的能力更强(Plt;0.05)。<br>　　3.HS-SA对角质细胞和皮脂腺细胞炎症的影响<br>　　TNF-α能诱导HaCaT细胞和SZ95细胞促炎因子IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的表达量增高。TNF-α刺激24h促炎因子表达量最高，具有时间依赖性；C.acnes诱导细胞促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8mRNA的表达增高，在12h表达量最高，24h有所降低。50μMHS-SA、ADT-OH、SA预处理可以抑制由TNF-α引起的促炎因子mRNA表达升高。同等浓度的HS-SA比ADT-OH、SA有更强的抑制IL-6和IL-8的作用。50μMHS-SA、ADT-OH、SA预处理可以抑制由C.acnes引起的促炎因子mRNA表达升高。同等浓度的HS-SA比ADT-OH、SA有更强的抑制促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8的作用。50μMHS-SA、ADT-OH、SA预处理可以抑制由C.acnes引起的ROS水平升高，同等浓度下HS-SA与SA相比效果更显著(Plt;0.05)，但与ADT-OH组无明显差异(Pgt;0.05)。<br>　　4.HS-SA对兔耳痤疮样皮肤炎症的影响<br>　　模型组兔耳炎症反应较重，局部皮肤粗糙增厚，毛囊口扩张，散在红色炎性丘疹，毛细血管扩张；基质组较模型组未见明显改善。HS-SA、ADT-OH、SA、维A酸组兔耳粗糙增厚减轻，毛囊口稍缩小，未见明显丘疹；肉眼观察可见HS-SA组、ADT-OH组、SA组和维A酸组疗效均优于基质组，炎症均明显减轻。<br>　　HE结果显示模型组和基质组较正常对照组表皮明显增厚、毛囊周围炎性细胞明显增多，HS-SA组、ADT-OH组、SA组和0.025%维A酸组较基质组表皮厚度减小，炎细胞数量减少，其中HS-SA组比SA组表皮厚度减小更明显(Plt;0.05)，但较ADT-OH组无明显差异(Pgt;0.05)；HS-SA组比ADT-OH组和SA组炎细胞数量减少，结果具有统计意义(Plt;0.05)。免疫组化的结果显示IL-1β、TNF-α、COX-2、NF-κBP65和IκBα等炎性指标在基质组中明显增强，而HS-SA、ADT-OH、SA和维A酸外用干预后上述指标表达减少，其中HS-SA组的NF-κBP65和IκBα表达较ADT-OH组和SA组减少(Plt;0.05)。<br>　　5.HS-SA对皮脂腺细胞脂质产生的影响<br>　　尼罗红和油红染色显示：LA诱导SZ95细胞和原代人皮脂腺细胞胞质中脂滴增多，HS-SA、ADT-OH、SA都可以减少由LA诱导的脂滴增多。在SZ95细胞中，HS-SA比ADT-OH抑制脂滴产生更显著(Plt;0.05)；在原代皮脂腺细胞中，三种药物之间无明显差异(Pgt;0.05)。qPCR显示LA诱导SREBP-1表达升高，HS-SA、ADT-OH、SA能减少由LA诱导的SREBP-1增多，但三种药物之间对SREBP-1表达的影响无明显差异(Pgt;0.05)。LA诱导SZ95和原代人皮脂腺细胞甘油三酯增多，HS-SA、ADT-OH、SA减少由LA诱导的甘油三酯增多，其中HS-SA较ADT-OH显示出更强的抑制甘油三酯的效应(Plt;0.05)，但与SA之间无明显差异(Pgt;0.05)。<br>　　6.HS-SA对痤疮相关致病菌生长的影响<br>　　HS-SA、ADT-OH和SA对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌可以产生抑菌性，在39.06-156.25μg/mL浓度范围内，HS-SA、ADT-OH及SA能够抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌的生长，同等浓度下ADT-OH抑菌效果最好。<br>　　7.HS-SA抗炎机制的探究<br>　　转录组测序检测到表达基因27870个。KEGG分析显示C.acnes_VS_NC差异基因主要富集在Toll样受体信号通路、细胞因子与细胞因子受体相互作用、NF-κB信号通路、TNF信号通路等；而HS-SA+C.acnes_VS_C.acnes的差异基因主要富集在MAPK通路、药物代谢-细胞色素P450、白介素-17信号通路、Wnt信号通路等。WesternBlot显示C.acnes可以诱导MAPK信号通路中P38、JNK、ERK的磷酸化，加入HS-SA能够抑制P38和JNK的磷酸化，但不抑制ERK的磷酸化；C.acnes可以诱导NF-κB信号通路中P65、IκBα的磷酸化，而HS-SA能够抑制P65、IκBα的磷酸化。免疫荧光显示C.acnes诱导NF-κB信号通路中P65入核增多，而HS-SA能够抑制p65入核。兔耳痤疮模型中，基质组NF-κBP65和IκBα表达升高，而外用HS-SA组NF-κBP65和IκBα表达减少。<br>　　加入P38MAPK通路抑制剂(SB203580)和NF-κB通路抑制剂(PDTC)可以减少由C.acnes诱导的IL-6mRNA表达升高，HS-SA和P38MAPK抑制剂、NF-κB通路抑制剂在抑制IL-6上具有类似的效应。<br>　　结论：<br>　　1.合成了一种具有痤疮治疗潜力的新化合物，即硫化氢水杨酸接合物(HS-SA)。<br>　　2.发现HS-SA能够抑制角质形成细胞和皮脂腺细胞的增殖、诱导凋亡、抑制由C.acnes诱导的炎症、减少皮脂腺细胞脂质产生，HS-SA能够抑制金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、痤疮丙酸杆菌的生长；其中，HS-SA的抗炎效果优于其单体，ADT-OH和SA。<br>　　3.揭示了HS-SA可能是通过抑制C.acnes活化的p38MAPK和NF-κB信号通路来发挥抗炎功效。