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摘要目的：<br>　　良性前列腺增生（Benign prostatic hyperplasia, BPH）所引起的下尿路症状是目前影响全世界中老年男性健康、生活质量的重要因素，随着全球老龄化加剧，其所带来的医疗、经济负担日益增加。目前 BPH 的发生与发展机制尚不明确，但其与老龄化之间的关系是被学界广泛认知的。BPH病理学改变以前列腺移行区组织的增生为主。前列腺增生时，随着前列腺组织的结节状增生及前列腺包膜的限制，前列腺间质及上皮的弹性成分，特别是细胞外基质成分，构成BPH的被动张力。BPH增生结节中的平滑肌细胞受到α-肾上腺素能神经调控，诱发平滑肌细胞的收缩与舒张，构成BPH的主动张力。BPH的主动张力与被动张力构成了BPH组织内部的内源性力学微环境。随着年龄的增长，细胞外基质在老龄化、疾病化的过程中呈现动态变化。在器官的发育和组织损伤修复过程中，细胞-细胞外基质与细胞-细胞之间的相互作用力对于细胞的生物学特性至关重要。但是目前对于力学转导是如何调控细胞和组织功能机制尚不完全明确。细胞生物力学微环境的改变会体现在细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）硬度的变化上。ECM组成的差异导致了不同组织中独特的三维结构，并决定了细胞习性和生长的基质的硬度或弹性。已有的研究证实：微环境的这种物理特征深刻影响细胞表型，不仅影响细胞的形态，而且影响细胞骨架组织和运输。ECM的硬度已被证明可以调节细胞的生长、迁移和分化，以及许多其他重要的细胞行为。通过开展本次研究，我们旨在探寻细胞外基质硬度（组织硬度）变化与BPH发生发展的关系及其潜在机制。本研究将从以下四个方面展开：（1）通过构建本中心前瞻性前列腺疾病弹力超声队列探究BPH患者组织硬度的变化及其影响因素；（2）通过体外模型初步验证临床队列发现并进行转录组测序探寻潜在机制；（3）体外实验验证机制通路；（4）小鼠模型验证BPH组织弹性、相关基因表达等情况。<br>　　材料和方法：<br>　　首先，纳入自2022年1月-2022年12月期间，四川大学华西医院泌尿外科因前列腺增生入院拟手术治疗的患者（BPH组）及门诊因前列腺炎就诊的患者（对照组）。在治疗开始前接受经直肠前列腺彩超+剪切波弹性成像（SWE）检查并获取常规超声结果及前列腺组织硬度测值（弹性模量 E），并收取患者手术病理标本送Masson染色评估组织纤维化程度。使用单因素回归分析、趋势检验、广义相加模型拟合曲线、阈值效应分析等方法来探究各指标之间的相关性。<br>　　随后将前列腺基质细胞（WPMY-1）种于预铺有硬度参数分别为0.5kPa和64kPa的基质胶的6孔板上进行培养，后通过细胞周期检测及EdU染色的方式检测细胞增殖情况，并通过鬼笔环肽染色鉴定细胞形态。接下来将干预后的细胞送转录组测序，并通过GSEA富集分析寻找潜在的关键通路。并在人体及小鼠前列腺组织中进行免疫组织化学染色验证测序发现的关键分子的表达情况。<br>　　在根据转录组测序结果筛选出关键通路及靶点后。我们继续使用上述64kPa及 0.5kPa 硬度的基质胶对 WPMY-1 细胞进行模拟细胞外基质硬度变化干预，并使用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）及免疫印迹实验（Western blot, WB）验证关键通路的分子表达的情况。后续在这种干预基础上加入关键分子的小分子抑制剂（Nrf2抑制剂-ML385），应用同前方法检测相关分子在RNA及蛋白水平的表达变化。<br>　　完成体外实验验证后，我们建立小鼠模型并验证前述研究发现，我们将小鼠分为四组：对照组，丙酸睾酮造模组（BPH组），BPH+ML385组及BPH+RSL3 （铁死亡诱导剂）组。完成造模后，收取小鼠前列腺标本，应用前列腺指数 （PI1000）对小鼠BPH程度进行评估，使用动态力学分析技术检测小鼠前列腺组织硬度，通过Masson染色评估前列腺纤维化情况，免疫组织化学染色评估前述相关分子的表达情况。<br>　　结果：<br>　　根据前列腺弹力超声临床队列的数据，首先，我们发现了BPH患者前列腺移行带组织硬度（TZ Emean）较正常前列腺显著升高（42.25kPa vs 24.55kPa， Plt;0.05）。此外，在相关性分析中，我们发现：TZ Emean随着年龄增长与前列腺体积（包括移行带体积）增大逐渐上升，且其变化趋势均为线性相关（Pfor linearitylt;0.01）；TZ Emean与患者fPSA及TPSA水平存在显著的线性正相关（二者Pfor linearitylt;0.05），前列腺总体体积和移行带体积也与fPSA水平和TPSA水平呈线性正相关（Pfor linearitylt;0.05）；在本队列的BPH患者中，前列腺突入膀胱的发生率高达89%，前列腺与移行带体积增大与此现象发生的风险显著相关（二者Pfor linearitylt;0.01），此外，TZ Emean增加也使其发生风险升高（Plt;0.05）；在彩超下可以发现部分BPH患者（14%）存在前列腺推挤尿道的情况，移行带组织硬度增加可增加这一事件的风险（Pfor linearitylt;0.05）；将手术标本进行Masson染色后发现 TZ Emean 与组织 Masson 染色比例呈显著线性正相关（ Pfor linearitylt;0.01）。<br>　　在细胞实验中，我们发现在不同细胞外基质硬度下培养的WPMY-1形态存在显著差异（64kPa条件下培养的细胞形态类似于纺锤形及梭形，0.5kPa条件下培养的细胞形态接近圆形或半圆形），且在 64kPa 硬度的基质胶上培养的细胞增殖活性较0.5kPa硬度显著升高。在接下来的转录组测序中共检测到了1560个差异基因（821个上调，739个下调）（64kPa vs 0.5kPa），并在GSEA富集分析中发现铁死亡相关通路出现了差异性改变，并且其中上调明显且表达量较高的铁死亡相关基因是 GPX4。后续我们在人体前列腺组织及小鼠前列腺组织对GPX4和其上游转录因子Nrf2进行免疫组化染色发现BPH组织中GPX4和Nrf2 的表达均显著高于正常前列腺组织。<br>　　基于转录组测序的发现及组织标本中的表达检测对比，我们在WPMY-1细胞模型中继续进行通路的验证，在不同细胞外基质硬度（64kPa vs 0.5kPa）的刺激下，WPMY-1细胞中的GPX4水平在RNA水平显著升高，而在WB检测中， 64kPa组细胞的GPX4蛋白表达量显著升高，Nrf2的磷酸化蛋白p-Nrf2显著升高。在后续进一步验证中，Nrf2 小分子抑制剂 ML385 的加入可以有效抑制WPMY-1细胞中Nrf2和GPX4在RNA水平及蛋白水平（及磷酸化蛋白）的表达。<br>　　在小鼠模型中我们发现，首先在丙酸睾酮造模（BPH组）小鼠前列腺指数高于对照组小鼠（Plt;0.01），提示造模成功。BPH 组小鼠组织硬度及组织纤维化程度显著高于对照组并高于BPH+ML385及BPH+RSL3（铁死亡诱导剂）组（Plt;0.01）。在免疫组化染色结果中发现BPH组小鼠前列腺GPX4、Nrf2表达量显著高于对照组，铁死亡诱导剂 RSL3 显著降低了 GPX4 表达量，但其导致Nrf2 的表达量呈反应性上调，Nrf2 抑制剂 ML385 可显著降低二者的表达。ML385及RSL3均可以降低小鼠的组织硬度并减轻组织的纤维化程度，RSL3的抑制程度高于ML385。<br>　　结论：<br>　　本研究将SWE技术运用到了BPH患者的诊疗中，并且首次构建了前列腺疾病弹力超声队列，首次发现了BPH患者前列腺移行带组织硬度显著高于正常前列腺，并且组织硬度的升高也与患者年龄、前列腺体积、PSA 水平、长大的前列腺突入膀胱、前列腺压迫尿道及组织纤维化程度等临床指标显著相关。并且在后续的细胞实验、转录组测序及动物实验中发现细胞外基质硬度增加可以通过上调Nrf2/GPX4通路，抑制铁死亡的发生，促进前列腺基质细胞的增殖，从而在宏观层面促进了BPH疾病的发生与发展。并且提示了铁死亡通路及其激动剂可能成为未来BPH防治中的重要靶点。