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摘要目的：<br>　　睡眠是生命活动的重要组成部分，良好的睡眠对人体健康必不可少。随着社会经济的快速发展和工作生活压力的不断增加，睡眠障碍已成为世界范围内公共卫生领域的重大问题。既往研究表明，睡眠障碍会增加多种疾病的风险，如心血管疾病、代谢性疾病和精神性疾病等。近期，有报道指出睡眠障碍与勃起功能障碍(Erectile dysfunction, ED)可能具有相关性。然而，睡眠障碍是否能够导致ED及其潜在分子机制尚不清楚。因此，我们基于临床研究的线索，通过动物和细胞实验，验证睡眠障碍与ED的因果关系，探索睡眠障碍导致ED的潜在分子机制，以期为ED合并睡眠障碍患者的诊断和治疗提供新的策略。<br>　　材料和方法：<br>　　1.收集我院男科门诊就诊患者的资料，包括基线信息、勃起功能、睡眠质量、抑郁和焦虑评估情况等，纳入标准包括本院初诊、年龄大于18岁、半年内有性生活史和两周内未使用5型磷酸二酯酶抑制剂。使用相关分析、分层分析、logistic回归和限制性立方样条回归，分析ED与睡眠质量的相关性，明确睡眠障碍是否为ED的危险因素。之后，对部分使用助眠药物治疗的患者进行随访，获取治疗后的信息，了解提高睡眠质量对ED合并睡眠障碍患者勃起功能的改善作用，探索睡眠障碍与ED的因果关系。<br>　　2.采用全自动大小鼠睡眠剥夺仪对大鼠进行不同时间的睡眠剥夺，建立多种短睡眠时间的睡眠障碍动物模型，通过测定大鼠阴茎海绵体内压和平均动脉压评估勃起功能，了解不同时间睡眠剥夺对大鼠勃起功能的影响，明确睡眠障碍与ED之间的因果关系。通过苏木精-伊红染色和Masson三色染色法了解睡眠剥夺大鼠阴茎组织结构改变和纤维化情况，采用转录组测序和实时荧光定量聚合酶链反应筛选与睡眠剥夺大鼠发生ED有关的分子通路。使用蛋白印迹法(Western blotting, WB)、免疫组化和免疫荧光检测勃起相关分子在阴茎组织中的表达情况，了解睡眠剥夺大鼠阴茎组织勃起相关分子表达的变化，初步确立睡眠障碍导致ED的分子机制。<br>　　3.通过睡眠剥夺的方法建立短睡眠时间的睡眠障碍动物模型，以72小时睡眠剥夺大鼠为模型组，72小时睡眠剥夺后进行48小时恢复性睡眠的大鼠为干预组。通过测定大鼠阴茎海绵体内压和平均动脉压评估勃起功能，了解恢复性睡眠对睡眠剥夺大鼠ED的改善作用。使用WB、免疫组化和免疫荧光检测大鼠阴茎组织中勃起相关分子的表达情况，了解恢复性睡眠对睡眠剥夺大鼠阴茎组织勃起相关分子表达的影响，进一步确认睡眠障碍导致ED的分子机制。<br>　　4.通过睡眠剥夺的方法建立短睡眠时间的睡眠障碍动物模型，以72小时睡眠剥夺大鼠为模型组，72小时睡眠剥夺过程中给予通路抑制剂的大鼠为干预组。通过测定大鼠阴茎海绵体内压和平均动脉压评估勃起功能，了解抑制相关分子通路对睡眠剥夺大鼠ED的逆转作用。使用WB、免疫组化和免疫荧光检测大鼠阴茎组织中勃起相关分子的表达情况，明确抑制剂对睡眠剥夺大鼠阴茎组织相关分子通路的抑制作用，验证睡眠障碍导致ED的分子机制。<br>　　5.酶联免疫吸附实验检测各组大鼠血清睾酮、皮质醇和去甲肾上腺素水平，探索睡眠剥夺导致大鼠发生ED的神经内分泌因素。体外培养大鼠阴茎海绵体平滑肌细胞，利用通路抑制剂、激动剂、受体拮抗剂和转染敲低的方法对细胞进行分组干预。观察细胞形态改变，使用细胞计数试剂盒8测定各组细胞的活力，通过WB和免疫荧光检测细胞中相关分子通路的表达变化情况，研究睡眠剥夺大鼠阴茎组织相关分子通路变化的原因，探索睡眠障碍导致ED的中间机制。<br>　　结果：<br>　　1．本研究共收集到316例门诊患者勃起功能与睡眠质量的相关资料，其中251例患者符合纳入标准被纳入研究。研究对象的中位年龄为33岁，其中224例(89.2%)存在ED，199例(79.3%)存在不同程度的睡眠障碍，185例(73.7%)为ED合并睡眠障碍。相关分析与分层分析表明，ED与睡眠质量具有相关性，睡眠质量越差的患者，其勃起功能越差、ED的程度越严重。通过logistic回归分析发现，睡眠障碍可能是ED的独立危险因素之一。限制性立方样条回归表明，ED与睡眠质量之间存在非线性关系，睡眠质量越差，ED程度可能更加严重。对31例ED合并睡眠障碍患者的随访资料表明，助眠药物治疗可提高患者的睡眠质量并改善其勃起功能，提示睡眠障碍与ED之间可能存在因果关系。<br>　　2．睡眠剥夺可损害大鼠勃起功能，导致大鼠发生ED，睡眠剥夺时间对勃起功能的影响具有明显的剂量-效应关系。睡眠剥夺大鼠阴茎组织形态未出现显著异常，但Masson三色染色表明睡眠剥夺大鼠阴茎海绵体平滑肌/胶原比例降低，发生纤维化改变。转录组测序提示睡眠剥夺大鼠阴茎组织差异表达基因富集于血管平滑肌收缩和Ras同源基因家族成员A(Ras homolog gene family member A, RhoA)/Rho相关含卷曲-螺旋蛋白激酶(Rho-associated coiled-coil containing kinase, ROCK)相关的通路，实时荧光定量聚合酶链反应提示睡眠剥夺大鼠阴茎组织RhoA/ROCK通路分子基因转录水平显著增高。WB、免疫组化和免疫荧光检测结果表明睡眠剥夺大鼠阴茎组织RhoA/ROCK通路异常活化，并存在内皮功能障碍，提示睡眠障碍可能通过RhoA/ROCK通路导致ED。<br>　　3．恢复性睡眠能够明显改善睡眠剥夺大鼠的ED。同时，Masson三色染色提示恢复性睡眠可改善睡眠剥夺大鼠阴茎海绵体纤维化。WB、免疫组化和免疫荧光检测结果表明，恢复性睡眠可抑制睡眠剥夺大鼠阴茎组织RhoA/ROCK通路活化，但不能改善阴茎海绵体内皮功能障碍，提示恢复性睡眠可能通过抑制RhoA/ROCK通路改善睡眠障碍导致的ED。<br>　　4．ROCK抑制剂可逆转睡眠剥夺大鼠的ED，恢复大鼠的勃起功能。Masson三色染色提示ROCK抑制剂不能改善睡眠剥夺大鼠阴茎海绵体纤维化。WB、免疫组化和免疫荧光检测结果表明，ROCK抑制剂能够显著抑制睡眠剥夺大鼠阴茎组织RhoA/ROCK通路异常活化，但不能改善阴茎海绵体内皮功能障碍，提示睡眠障碍可能通过RhoA/ROCK通路导致ED，抑制RhoA/ROCK通路可改善睡眠障碍导致的ED。<br>　　5．酶联免疫吸附实验表明，睡眠剥夺可导致大鼠血清皮质醇水平升高，恢复性睡眠后皮质醇水平出现下降，这与睡眠剥夺大鼠勃起功能改变和阴茎组织RhoA/ROCK通路活化的趋势一致，提示睡眠剥夺大鼠循环皮质醇水平升高可能与阴茎组织RhoA/ROCK通路异常活化和ED发生有关。细胞实验中观察到，皮质醇可增强血管紧张素II诱导的阴茎海绵体平滑肌细胞收缩。WB与免疫荧光检测结果表明，皮质醇并不能诱导阴茎海绵体平滑肌细胞RhoA/ROCK通路活化，但皮质醇可产生允许作用，显著增强血管紧张素II诱导的RhoA/ROCK通路活化。同时，使用ROCK抑制剂和敲低RhoA表达可抑制皮质醇增强阴茎海绵体平滑肌细胞RhoA/ROCK通路活化的作用，而糖皮质激素受体拮抗剂则可阻断皮质醇的允许作用，抑制RhoA/ROCK通路活化。以上结果提示循环皮质醇水平增加并产生允许作用可能是睡眠剥夺大鼠阴茎组织RhoA/ROCK通路异常活化的神经内分泌因素和睡眠障碍导致ED的中间机制。<br>　　结论：<br>　　1.ED与睡眠质量具有相关性，睡眠障碍可能是ED的独立危险因素之一，提高睡眠质量有助于改善ED合并睡眠障碍患者的勃起功能。<br>　　2.睡眠障碍与ED之间存在因果关系，睡眠障碍导致ED的主要分子机制可能是：睡眠障碍引起下丘脑-垂体-肾上腺轴过度活动，导致循环皮质醇水平升高并产生允许作用，使阴茎海绵体平滑肌细胞RhoA/ROCK通路异常活化，最终导致阴茎海绵体平滑肌收缩和ED发生。<br>　　3.本研究可能有助于我们进一步认识睡眠障碍导致ED的分子机制，并对临床上ED合并睡眠障碍患者的治疗提供新的思路和线索。