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基于氧化黄原胶的可注射导电水凝胶的制备及其在心肌梗死治疗中的研究

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摘要背景和目的 　　心肌梗死(myocardial infarction，MI)对心肌造成不可逆损伤，是世界范围内导致死亡率最高的疾病之一。冠状动脉阻塞阻碍氧气和营养物质的运输，导致大量心肌细胞坏死、室壁变薄，左心室扩张、心功能障碍，最终导致心力衰竭。成人心肌组织中心肌细胞有限的再生能力显著限制了心肌自我修复功能。心肌梗死的临床常用治疗方法有药物治疗、经皮冠状动脉介入治疗、冠状动脉搭桥术等。然而，这些方法只能延缓心室重构的过程，而不能恢复梗死心肌。心脏移植受供体器官来源不足和免疫排斥反应的限制。因此，迫切需要新的、改进的治疗策略来提高心肌梗死的治疗效果。 　　可注射水凝胶可能对心肌梗死后心脏组织的修复具有重要意义。他们可以单独使用，为梗死心室壁提供机械支撑，降低心室壁应力，减少心脏机械负荷;也可以负载一些生物治疗剂如蛋白质、多肽、核酸药物和干细胞，以增加它们在心脏中的滞留和存活，并防止全身性的不良反应。同时注射后在梗死区原位形成理想的三维修复微环境，实现生物活性物质或药物分子的局部缓控释，提高他们的治疗效果。明胶和黄原胶(XG)具有良好的生物相容性和生物降解性，且易于修饰，已在组织工程应用中得到广泛研究，适合作为水凝胶原材料。 　　心肌梗死后，心肌细胞大量死亡，炎症微环境推动不利的纤维化重塑。高度有序的心肌随后被相对无序的纤维化组织占据。基质中过度和持续的纤维化沉积会破坏健康部位和梗死部位之间的电完整性，中断电信号传导，从而导致收缩和舒张功能障碍以及心律失常。治疗心肌梗死最关键的挑战之一是恢复梗死区正常的电脉冲传播，恢复梗死心室中的机电耦合，重新实现同步收缩，并防止不良重塑和心室功能障碍。虽然大量可注射水凝胶已被用于心肌梗死的治疗，但它们通常不能同时满足生物相容性、电导率和机械性能与天然心肌相匹配的要求。其治疗策略不能同时覆盖心梗后病理发展的全部阶段。导电材料可以增强水凝胶的导电性，桥接健康心肌和瘢痕组织之间的电信号，触发电脉冲在梗死区的传播，促进梗死后心脏组织的同步收缩。聚吡咯(PPy)作为一种导电材料因其优异的导电性和生物相容性，在生物医学领域得到广泛的研究，但由于其机械脆性和水不溶性，实际应用受到限制。 　　基于以上研究背景，为构建更理想的用于心梗治疗的水凝胶支架材料，本文第一章构建了基于氧化黄原胶(OXG)的导电水凝胶体系。该体系以明胶和氧化黄原胶作为水凝胶主体(OG)，随后将PPy接枝到明胶上形成的导电复合材料(GP)添加到OG水凝胶中以制备导电水凝胶(OGGP)。该体系的创新性在于所设计的水凝胶具有与天然心肌相匹配的生物相容性、电导率和机械弹性，满足理想心脏支架设计的要求，更适用于心梗后的心肌修复。 　　本文第二章为进一步提高对心肌梗死的治疗效果，设计了基于氧化黄原胶的心梗微环境响应性释药的导电水凝胶体系(OGDPR)。对XG和明胶分别修饰构建动态双网络水凝胶(OGD)。在添加GP保持其导电性的同时负载聚多巴胺-迷迭香酸(PDA-RA)纳米粒协同治疗心肌梗死。该体系的创新性在于响应性释药体系的构建及覆盖心肌梗死病理发展不同阶段的协同治疗策略。 　　方法 　　第一章：本研究通过席夫碱反应制备基于氧化黄原胶的水凝胶OG，利用自由基聚合反应将PPy接枝到明胶上以改善其水溶性，将导电复合材料GP掺入OG水凝胶中构建更均匀的导电水凝胶体系OGGP。采用1HNMR、FT-IR、SEM等方法对聚合物和水凝胶的结构和形貌进行表征。采用“倒置瓶法”研究水凝胶的凝胶时间。采用称重法检测水凝胶的溶胀性。通过电阻率仪和电化学工作站测试水凝胶的电化学性能。通过万能试验机测试水凝胶的机械性能。利用流变仪检测水凝胶的流变学特性和自愈合性能。通过DPPH清除实验考察水凝胶清除活性氧(ROS)的效果。并对水凝胶的体外血液安全性，生物相容性及体内外降解进行全面考察。建立大鼠急性心肌梗死模型，注射水凝胶进行治疗。采用超声心动图评估水凝胶对大鼠心梗后心功能的保护效果。利用心电图(ECG)评价水凝胶对梗死心脏电生理的保护效果。利用电刺激仪对梗死心脏施加单个或多个电刺激，评估其对诱发性心律失常的易感性。采用电阻率仪测试心肌瘢痕组织电阻率。Masson三色染色用以评价心脏的室壁厚度和梗死面积，苏木精-伊红(Hamp;E)染色用以评估水凝胶对大鼠脏器的病理学毒性。通过免疫荧光染色评价水凝胶对心脏特异性标志物的表达、血管生成和炎症清除的影响。 　　第二章：该部分构建了心梗微环境响应性的水凝胶OGD，通过加载PDA-RA纳米粒和导电材料GP构建载药导电水凝胶OGDPR，以增强对心肌梗死的治疗效果。通过1HNMR、FT-IR、SEM对聚合物和水凝胶的结构和形貌进行表征。利用马尔文粒度仪、TEM对纳米粒的粒径、电位、形貌进行表征。采用“倒置瓶法”检测水凝胶的凝胶时间。通过注射器推送测试水凝胶的可注射性。通过称重法检测水凝胶的溶胀性。采用紫外-可见分光光度计考察了纳米粒的载药量和水凝胶的释药特性。通过电导率仪和电化学工作站对水凝胶的电化学性能进行表征。水凝胶的机械性能通过万能试验机进行测试。采用流变仪检测水凝胶的流变学特性、剪切变薄特性和自愈合性能。利用DPPH清除实验考察水凝胶体外抗氧化的效果。通过CCK-8及活/死细胞染色实验评价水凝胶的生物相容性和保护细胞抵抗氧化应激的能力。通过细胞迁移和管形成实验检测水凝胶对内皮细胞的增殖和成管作用。采用体外溶血实验考察水凝胶的血液安全性。通过体内降解实验考察水凝胶的生物降解能力。建立大鼠急性心肌梗死模型，注射水凝胶进行治疗。通过超声心动图对大鼠心梗后心功能进行考察。利用心电图评价水凝胶对梗死心脏的电生理保护效果。通过电刺激仪对梗死心脏施加单个或多个电刺激，考察其对诱发性心律失常的易感性。采用电阻率仪测试心肌瘢痕组织电阻率。通过Masson三色染色评价心脏的室壁厚度、梗死面积和纤维化面积。通过Hamp;E染色考察水凝胶对大鼠脏器的病理学毒性。通过血生化指标检测水凝胶的全身毒性。通过免疫荧光染色评价水凝胶对炎症清除、细胞凋亡、细胞增殖、血管生成和心脏特异性标志物的表达的影响。 　　结果 　　第一章： 　　(1)本章成功制备了一系列可注射自愈合水凝胶，经筛选，凝胶时间为127s的OG水凝胶满足临床上快速凝胶和可注射的需求。 　　(2)GP组分具有良好的水溶性。将导电组分GP引入OG水凝胶体系，通过调节GP组分的含量，得到GP含量为3wt%的OGGP3水凝胶具有较快的凝胶时间(23s)和适当的溶胀性。其电导率((5.52±0.37)×10?4S/cm)和机械弹性(20.77 kPa)与天然心肌相匹配。流变学实验表明水凝胶具有良好的流变学特性和自愈合性能。水凝胶具有体外清除ROS的效果。 　　(3)OGGP3水凝胶具有较低的细胞毒性，48h细胞活力大于90%，生物相容性好。血液安全性考察，水凝胶溶血率低于5%，无明显溶血现象发生。 　　(4)水凝胶在体内外均表现出可生物降解性。植入大鼠皮下后可在原位形成稳定的水凝胶，随着时间的推移而逐渐降解，水凝胶皮下降解速度较慢，降解过程中对组织没有明显的毒副作用。水凝胶注射到梗死心肌后显示在梗死心脏的各个层面均有分布，且随着时间推移内部结构逐渐崩塌，表现出良好的心脏原位病理条件下的降解性。 　　(5)超声心动图结果显示，OGGP3水凝胶可改善心梗后的心功能，有效地阻止了左心室梗死扩张和心室重塑。心电图结果显示OGGP3水凝胶可显著缩短QRS和QT间期，恢复心脏正常的心电图波形。程控电刺激实验表明OGGP3可显著降低大鼠心律失常的易感性。瘢痕电阻率测试表明注射OGGP3的组织电阻率明显降低。 　　(6)病理切片分析，Masson三色染色显示OGGP3水凝胶可显著增加梗死心脏的室壁厚度，减小梗死面积。Hamp;E染色显示水凝胶未造成明显的脏器毒性。 　　(7)免疫荧光染色分析，OGGP3水凝胶可显著增加心脏特异性标志物α-辅肌动蛋白(α-actinin)和连接蛋白-43(CX-43)的表达，促进梗死区血管生成，减少梗死区炎症。 　　第二章： 　　(1)本章成功制备了聚多巴胺(PDA)纳米粒，有效吸附RA，形成PDA-RA纳米粒，载药量为(24.06±1.10)%，药物包封率为(63.42±4.71)%。 　　(2)成功制备了基于席夫碱键和硼酯键的双网络水凝胶OGD，凝胶时间为63s。加入PDA-RA纳米粒和导电组分GP后，形成交联网络更致密，凝胶时间为13s的OGDPR水凝胶。 　　(3)体外性能表征，水凝胶具有一定的溶胀性能，装载PDA-RA纳米粒的水凝胶OGDR和OGDPR均能响应于高ROS和低pH的心梗微环境，按需释放RA。OGDPR水凝胶具有与天然心肌相匹配的电导率(6.27×10-4S/cm)和机械性能(45.35 kPa)。流变学测试表明水凝胶具有良好的流变学性能、剪切变薄特性和自愈合性能。OGDPR水凝胶具有显著的清除ROS的效果。 　　(4)细胞水平实验，OGDPR水凝胶细胞毒性小，72h细胞活力大于80%，生物相容性好。水凝胶可以保护细胞避免H2O2诱导的氧化应激损伤。水凝胶在体外可以促进内皮细胞迁移和成管。血液安全性考察，所有水凝胶溶血率低于1%，无明显溶血现象发生。 　　(5)皮下注射水凝胶后可形成稳定的水凝胶，随着时间的延长逐渐降解代谢。Hamp;E染色证明降解过程中没有对组织产生明显的毒副作用，生物安全性好。水凝胶注射到梗死心肌后显示在梗死心脏中分布均匀，且随着时间推移逐渐降解，表现出良好的心脏原位病理条件下的降解性。 　　(6)超声心动图结果显示，OGDPR水凝胶可显著改善心梗后的心功能。心电图结果显示OGDPR水凝胶可恢复梗死区电信号传导，显著缩短QRS和QT间期，恢复心脏正常的心电图波形。程控电刺激实验表明OGDPR水凝胶可显著降低大鼠心律失常的易感性。瘢痕电阻率测试表明注射OGDPR水凝胶的心肌组织电阻率明显降低。 　　(7)病理学分析，Masson三色染色显示OGDPR水凝胶可显著增加梗死心脏的室壁厚度，减小梗死面积和纤维化面积。Hamp;E染色显示水凝胶没有引起原位炎症和明显的脏器毒性，具有良好的生物安全性。 　　(8)免疫荧光染色分析，OGDPR水凝胶可调节梗死区炎症反应，抑制细胞凋亡，促进细胞增殖和血管生成，显著增加心脏特异性标志物(α-actinin和CX-43)的表达。 　　结论 　　第一章：本研究通过席夫碱反应制备了可注射自愈合导电水凝胶OGGP3，该水凝胶具有与天然心肌相匹配的生物相容性、电导率和机械弹性。注射到大鼠梗死心脏后可逆转心肌梗死后心脏的不良重塑和梗死扩张，并改善心脏功能。OGGP3导电水凝胶具有作为一种安全且有效的心肌梗死治疗策略的临床应用潜力。 　　第二章：本研究成功构建了心梗微环境响应性的载药导电水凝胶，联合治疗方式可覆盖大鼠心肌梗死病理发展的多个阶段。一方面从水凝胶中释放的RA可以清除ROS并调节炎症微环境，抑制细胞凋亡，持续抑制心肌纤维化；另一方面PPy赋予水凝胶良好的导电性，并招募内皮细胞促进新血管形成。设计的水凝胶满足心肌梗死不同阶段的需求，增强心脏功能。本研究验证了将机械支持、抗细胞凋亡、抗炎、抗纤维化、恢复梗死区电信号传递等功能结合在一个水凝胶支架中的综合治疗策略的有效性，具有潜在的临床应用前景。