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摘要目的 制备壳聚糖胶束载体并对其进行表征，在此基础上进行体内外实验研究壳聚糖胶束载体的抗肿瘤血管生成作用，对其抗肿瘤血管生成的机制进行初步研究。<br>　　方法<br>　　1. 壳聚糖胶束载体的制备：（1）壳聚糖胶束载体的亲水外壳的制备：以壳聚糖（Chitosan, CS）为基本骨架，通过腙键（Hydrazone bond, Hz）将壳聚糖与亲水的聚乙二醇（Polyethylene glycol, PEG）相连，再将PEG与2-脱氧氨基葡萄糖(2-amino-2-deoxy-D-glucose, 2-DG）相连，对壳聚糖胶束进行靶向修饰。各部分之间的连接通过配体置换法完成；（2）壳聚糖胶束载体的疏水核心的制备：将疏水性的辛醛（octyl aldehyde, octyl）通过赖氨酸（lysine, Lys）与穿膜肽九聚精氨酸（9-D-arginine, 9R）连接构成疏水核心；（3）壳聚糖胶束载体的亲水外壳与疏水核心的组装：壳聚糖胶束载体的亲水外壳和疏水核心部分可以在水中进行自组装，最后通过透析法纯化即可获得DG-PEG-Hz-CS-octyl-Lys-9R胶束，命名为DG/Hz-CMs。<br>　　2. 壳聚糖胶束载体的表征：通过核磁共振氢谱碳谱分析、超高效液相质谱联用、SDS-PAGE凝胶电泳、透射电子显微镜、粒仪电位分析等对DG/Hz-CMs进行表征。<br>　　3. 壳聚糖胶束载体装载siRNA的能力：通过琼脂糖凝胶电泳实验验证载体装载小干扰 RNA(small interfering RNA, siRNA）的能力，对比不同比例的载体siRNA混合比例的siRNA装载效果，筛选合适的结合比,最终构建环氧合酶-2 (cyclooxygenase-2, COX-2) 小 干 扰 RNA 载 体 复 合 物，命 名 为DG/Hz-CMs/siCOX-2。<br>　　4. 体内外载体摄取情况：分别使用激光扫描共聚焦显微镜（confocal laser scanning microscope, CLSM）和荧光显微镜观察体外RAW264.7巨噬细胞和体内肿瘤组织部位巨噬细胞中装载了FAM-siNC的DG/Hz-CMs的内化情况。<br>　　5. 体外基因沉默和抗肿瘤血管生成作用：通过Transwell共培养实验模拟肿瘤微环境，进行免疫荧光实验，研究DG/Hz-CMs/siCOX-2对肿瘤相关巨噬细胞COX-2基因表达的影响。此外，我们通过划痕实验、侵袭实验、成管实验等，研究DG/Hz-CMs/siCOX-2体外抗肿瘤血管生成的作用。<br>　　6. 体内基因沉默和抗肿瘤血管生成作用：体内构建小鼠乳腺癌原位实体瘤模型，通过免疫组化观察DG/Hz-CMs/siCOX-2对体内肿瘤部位COX-2基因表达的影响。此外，我们通过测量小鼠肿瘤的体积，对血管指标CD31染色以及对小鼠尾静脉注射FITC-葡聚糖观察肿瘤生长曲线、肿瘤血管分布数量以及渗漏情况研究DG/Hz-CMs/siCOX-2抑制小鼠肿瘤生长、肿瘤血管生成和渗漏作用。<br>　　7. 壳聚糖载体的抗肿瘤血管生成机制：通过qRT-PCR实验检测体内小鼠肿瘤部位精氨酸酶1（Arginase1, Arg1）和一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS）的表达情况，对肿瘤相关巨噬细胞的免疫表型进行分析，研究DG/Hz-CMs/siCOX-2的抗血管生成机制。<br>　　结果<br>　　1. 核磁共振氢谱、碳谱分析验证氨基保护的羧甲基壳聚糖成功合成；核磁共振氢谱分析验证壳聚糖胶束外壳成功构建；超高效液相质谱联用、SDS-PAGE凝胶电泳实验验证载体疏水核心部分成功构建；琼脂糖凝胶电泳实验验证载体包载siRNA的能力及最佳结合比为40∶1；透射电子显微镜拍摄载体相貌以及粒径检测得到载体呈现球形且粒径在122.69 nm左右，电位为 -26.72 mV左右。<br>　　2. CLSM观察细胞对载体的体外体外摄取能力，实验结果显示，与无DG修饰的Hz-CMs相比，有DG修饰的DG/Hz-CMs在相同时间内进入RAW264.7巨噬细胞的量更多，对巨噬细胞靶向性更好。<br>　　3. 荧光显微镜观察细胞对载体的体内摄取能力，实验结果显示，修饰了DG后，DG/Hz-CMs在相同时间内进入肿瘤部位巨噬细胞的量更多，对巨噬细胞靶向性更好。<br>　　4. 免疫荧光实验评价壳聚糖胶束载体的体外基因沉默效果，结果显示DG/Hz-CMs/siCOX-2对巨噬细胞的COX-2基因表达具有显著抑制作用。<br>　　5. 体外抑制肿瘤血管生成作用研究表明，DG/Hz-CMs/siCOX-2对肿瘤相关巨噬细胞诱导内皮细胞迁移、侵袭、小管生成能力的抑制作用更强，具备体外抗肿瘤血管生成能力。<br>　　6. 免疫组化实验评价壳聚糖胶束载体的体内基因沉默效果，结果显示DG/Hz-CMs/siCOX-2对肿瘤部位的COX-2基因表达具有显著抑制作用。<br>　　7. 体内抑制肿瘤血管生成作用研究表明，DG/Hz-CMs/siCOX-2对小鼠乳腺癌原位瘤生长、肿瘤血管生成以及血管渗漏的抑制作用更强，具备体内抗肿瘤生长、抗肿瘤血管生成及促血管正常化作用。<br>　　8. qRT-PCR实验结果证明DG/Hz-CMs/siCOX-2对肿瘤相关巨噬细胞的免疫表型有影响，肿瘤部位M2表型标记物Arg1表达下降，而M1表型标记物iNOS表达提高，具备将肿瘤相关巨噬细胞从M2表型逆转到M1表型的能力。<br>　　结论<br>　　1. 本课题成功设计并制备了壳聚糖胶束载体DG/Hz-CMs，呈现近球形，分散均匀，粒径122 nm左右，电位为负，具有良好的siRNA包载能力以及体外体内靶向巨噬细胞的功能。<br>　　2. 本课题设计的靶向巨噬细胞的DG/Hz-CMs/siCOX-2在体内外实验中均可以抑制肿瘤相关巨噬细胞COX-2基因的表达，并对肿瘤血管生成有着明显的抑制作用，具备促血管正常化的能力。<br>　　3. 本课题设计的靶向巨噬细胞的DG/Hz-CMs/siCOX-2可以逆转肿瘤相关巨噬细胞的免疫表型，达到抗肿瘤血管生成的作用。