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摘要目的：<br>　　本文旨在去除新鲜同种异体骨软骨移植物(osteochondral allografts, OCAs)软骨下骨中免疫原性成份（血液、细胞、脂质等），减少同种异体骨软移植中免疫排斥反应。本研究目的有以下几点：<br>　　1.为确定哪种物理方法能够有效去除OCAs软骨下骨中的免疫原性成份，同时不损害软骨的细胞活性、细胞外基质以及骨小梁结构，我们对各种物理方法进行系统验证，以期找到最佳的处理方法。<br>　　2.进一步验证高速离心（high-speed centrifugation, HSC）法的有效性和安全性：（1）分析不同的离心转速和时间对去除 OCAs免疫原性成份的影响，寻找最佳的离心转速和时间。（2）评估HSC法在处理 OCAs过程中的安全性，并分析其对OCAs体外保存的影响。<br>　　3.明确HSC法减少移植物-宿主免疫排斥反应的作用和机制。<br>　　方法：<br>　　1.我们研究了五种去除OCAs免疫原性成份的方法。总共 143个OCAs被获取，移植物均来自于猪膝关节（24个关节）的股骨髁。随后，将OCAs随机分为以下7组：（1）对照（control）组（n=17），（2）生理盐水（saline）组（n=21）， （3）超声（ultrasound）组（n=21），（4）涡旋振荡（vortex vibration, VV）组（n=21），（5）低速脉冲灌洗（low-pulse lavage, LPL）组（n=21），（6）高速脉冲灌洗（high-pulse lavage, HPL）组（n=21），（7）HSC组（n=21）。使用电子天平测量OCAs干重，通过宏观评价、组织学染色和DNA定量分析软骨下骨免疫原性成份去除效果，通过显微计算机断层扫描（micro-CT）评估软骨下骨完整性，通过活/死细胞染色和组织学染色评估软骨细胞活性和细胞外基质的完整性。此外，移植物软骨下骨被分区评估骨髓腔空白面积和有核细胞含量。<br>　　2.（1）我们设定了梯度离心转速和离心时间，并采用宏观评估、组织学染色、DNA定量和重量评估等方法，系统研究了这些参数对去除OCAs软骨下骨免疫原性成份的效果。（2）将HSC处理后的OCAs进行体外保存，7天后进行微生物检测、软骨活/死细胞染色和组织学染色，验证HSC法的安全性。<br>　　3.（1）通过 OCAs与RAW264.7细胞共培养构建体外移植物-宿主细胞免疫排斥反应模型，验证HSC法处理后的OCAs对宿主巨噬细胞的影响和炎症环境对OCAs软骨下骨内巨噬细胞的影响。（2）通过小鼠皮下包埋OCAs构建体内移植物-宿主免疫排斥反应模型，验证HSC法处理后的OCAs对宿主组织的影响。（3）通过离心管残留物与RAW264.7细胞共培养，验证OCAs软骨下骨内抗原物质（脂质、血液和细胞）分别对巨噬细胞的影响。<br>　　结果：<br>　　1.移植物干重、宏观评价、组织学染色和DNA定量均显示，与对照组相比， OCAs经saline、ultrasound或VV处理后软骨下骨免疫原性成份无明显减少，然而，LPL、HPL和HSC处理后免疫原性成份显著减少。此外，与LPL（P＜0.0001）和HPL（P＜0.0001）相比，HSC法更有效地降低了OCAs浅、中、深层的免疫原性成份。宏观评价、组织学染色和DNA定量显示HSC处理后，软骨下骨的血液、细胞和脂质等成份显著减少。Micro-CT和软骨活/死细胞染色结果显示，HSC未破坏骨小梁和软骨，然而，LPL和HPL可能会破坏骨小梁。<br>　　2.（1）通过宏观评估、组织学染色、DNA定量和重量评估发现离心转速为12000r/min和时间为1分钟时，可以最大程度地去除软骨下骨中免疫原性成份， HE染色显示免疫原性去除率达到91.18%。（2）采用HSC法进行操作，其流程简便且高效。通过微生物检测，确认未发现有任何OCAs的污染。软骨活/死细胞染色和组织学染色发现HSC法处理后不仅未破坏移植物软骨细胞活性，及细胞外基质和胶原纤维完整性，反而展现出对他们的保护作用。<br>　　3.（1）HSC法的应用，不仅减少了OCAs自身所含的免疫原性物质，更在降低受者免疫系统识别能力方面发挥了重要作用。这种双重效果有效削弱了宿主巨噬细胞的影响，进而显著降低了免疫排斥反应的发生概率。（2）通过小鼠皮下包埋OCAs构建体内移植物-宿主免疫排斥反应模型，我们发现HSC法可以减少宿主抗移植物反应。此外，OCAs软骨下骨的骨髓腔处于空洞状态，宿主的组织、血液和各种细胞等可以迅速进入软骨下骨内，可能会加速移植骨-宿主骨的整合。（3）通过离心管残留物与 RAW264.7细胞共培养，我们发现脂质、血液和细胞都会导致巨噬细胞极化，其中脂质影响最大。<br>　　结论：<br>　　1.HSC法不会破坏OCAs软骨细胞活性、骨小梁和细胞外基质，能够充分地去除软骨下骨中的血液、细胞和脂质等免疫原性成份，是移植前处理OCAs的最佳选择。<br>　　2.（1）HSC法可以高效地去除软骨下骨中免疫原性成份，转速为12000r/min和时间为1分钟能够对直径为8.5mm和软骨下骨厚度为6mm的OCAs清除效果最佳。（2）HSC法不会增加移植物污染的风险，而且在OCAs保存过程中，可能会保护软骨细胞活性，维持细胞外基质和胶原纤维的完整性。<br>　　3.HSC法通过减少OCAs软骨下骨中免疫原性成份，调节宿主巨噬细胞极化及炎症因子释放，降低免疫排斥反应。此外，宿主组织、血液和细胞可以快速进入HSC法处理后的软骨下骨空腔，这可能有利于异体骨和宿主骨的爬行替代和整合。