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摘要背景：<br>　　细胞衰老（cellular senescence）是一种与细胞周期永久性停滞相关的状态，特征表现为形态学变化、代谢调整、染色质结构重组以及基因表达模式的转变等一系列特定的表型变化。细胞衰老在神经退行性疾病中发挥重要作用。铝（Aluminum, Al）被认为通过对膜脂、蛋白质和抗氧化酶防御系统造成损伤来诱导氧化应激。因此，海马神经元不可避免地会受到 Al 的损伤，甚至可能出现细胞衰老。线粒体生物发生可微调线粒体的丰度和功能,过氧化物酶增殖体激活受体 γ 共激活因子-1α（Peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1α, PGC-1α）介导的线粒体生物发生可能参与调控神经元细胞衰老。近年来，细胞 RNA 的 N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）甲基化修饰已经成为表观遗传学领域的一个焦点。m6A修饰调控细胞中PGC-1α的表达和线粒体 DNA（Mitochondrial DNA, mtDNA）含量、mtDNA 编码的蛋白含量，并且参与线粒体的生物发生和能量的产生。去甲基化酶脂质和肥胖相关蛋白（Fat mass and obesity-associated protein, FTO）通过 m6A 修饰影响PGC-1α介导的线粒体生物发生可能与Al致神经元衰老有关，其机制仍需继续探索。<br>　　目的：<br>　　探究Al暴露是否影响小鼠海马神经元m6A修饰、PGC-1α介导的线粒体生物发生、神经元细胞衰老，综合探究 Al 引起的小鼠海马神经元衰老是否与线粒体生物发生有关，并探讨m6A去甲基化酶FTO影响线粒体生物发生的具体途径，对Al导致线粒体功能障碍的机制进行进一步探讨，为阐明Al神经毒性机制提供依据。<br>　　方法：<br>　　将HT22小鼠海马神经元细胞进行麦芽酚铝[Al(mal)3]染毒，实验分组设为空白对照组、麦芽酚组（120μmol/L）以及 60、120、240μmol/L Al 组。并且将带有 FTO基因的慢病毒转染入小鼠海马神经元细胞构建 FTO 过表达小鼠海马神经元细胞模型，设立对照组、Al 组（120μmol/L）、质粒空载组（NC）组、FTO 过表达组和FTO过表达+Al（120μmol/L）组。培养24h后，利用MeRIP-seq和RNA-seq技术测序，联合分析Al诱导小鼠海马神经元细胞的差异基因。通过相应的ATP含量试剂盒测定小鼠海马神经元细胞的ATP含量；荧光定量PCR和MeRIP-qPCR的结果验证差异基因的RNA m6A 甲基化水平；通过 β-半乳糖苷酶染色试剂盒测定细胞衰老变化；通过荧光定量PCR测定小鼠海马神经元细胞mtDNA、P16、P21、HMGA1、FTO、PGC-1α、NRF-1、NRF-2 和 TFAM mRNA 的相对表达水平；蛋白免疫印迹法测定小鼠海马神经元细胞 FTO、PGC-1α、NRF-1、NRF-2 和 TFAM 蛋白的相对表达水平。<br>　　结果：<br>　　1、 Al 对小鼠海马神经元细胞衰老的影响<br>　　与对照组相比，随着染 Al 剂量的上升，SA-β-gal 染色结果显示阳性细胞比例逐渐增加。小鼠海马神经元衰老基因 P16（F=381.227, P＜0.05）、P21（F=133.266, P＜0.05）和 HMGA1（F=212.879, P＜0.05）的 mRNA表达水平随着染 Al 剂量的升高而逐渐上升。与对照组（1.00±0.00）相比，60、120 和 240μmol/L Al 组 P16 mRNA表达水平分别上升至1.24±0.02（P＜0.05）、1.37±0.01（P＜0.05）和1.61±0.01（P＜0.05）， P21 mRNA表达水平分别上升至1.14±0.01（P＜0.05）、1.41±0.08（P＜0.05）和1.94±0.05 （P＜0.05），HMGA1 mRNA 表达水平分别上升至 1.25±0.03（P＜0.05）、1.37±0.02 （P＜0.05）和1.48±0.02（P＜0.05）。<br>　　2、Al对小鼠海马神经元mtDNA含量和ATP含量的影响<br>　　小鼠海马神经 mtDNA（F=262.070, P＜0.05）和 ATP（F=32.184, P＜0.05）含量随着染Al剂量的升高而逐渐下降。与对照组（1.00±0.00）相比，60、120和240μmol/L Al组的mtDNA含量分别下降至0.67±0.04（P＜0.05）、0.57±0.01（P＜0.05）和0.36±0.01（P＜0.05）。与对照组（814.97±96.18）相比，60、120 和 240μmol/L Al 组的 ATP含量分别是其52%、46%和22%（P＜0.05）。<br>　　3、RNA-seq与MeRIP-seq结果<br>　　结果显示染Al后小鼠海马神经元转录谱与m6A甲基化谱发生了变化。RNA-seq测序结果显示，与对照组相比，染Al后小鼠海马神经元有3037个上调基因和3332个下调基因；MeRIP-seq 测序结果显示：染 Al 后小鼠海马神经元 RNA m6A 有 8936个差异峰（包含7068个上调峰和1868个下调峰）。差异表达基因富集在细胞衰老通路及神经退行性疾病上，其中与细胞衰老相关 P16、P21、HAMGA1 等基因的mRNA表达水平在染Al后均显著上升，小鼠海马神经元突触相关蛋白SynapinⅢ、SynapinⅠ和Drebrin-like的表达水平下调。联合分析结果显示染Al后可以同时影响m6A水平及mRNA表达水平，差异基因在细胞衰老信号通路与ATP合成上富集，并与神经退行性疾病密切相关。<br>　　4、Al 对小鼠海马神经 FTO、PGC-1α、NFR-1、NRF-2 和 TFAM mRNA 表达水平的影响<br>　　小鼠海马神经 FTO（F=67.308, P＜0.05）、PGC-1α（F=273.643, P＜0.05）、NFR-1 （F=320.755, P＜0.05）、NRF-2（F=147.666, P＜0.05）、TFAM（F=154.831, P＜0.05）的mRNA表达水平随着染Al剂量的上升而逐渐下降。与对照组（1.00±0.00）相比， 60μmol/LAL 组的 FTO mRNA 表达水平稍有下降（P＞0.05），120 和 240μmol/L Al组的 FTO mRNA 表达水平别下降至 0.80±0.01 和 0.60±0.04（P＜0.05）。与对照组（1.00±0.00）相比，60、120 和240μmol/L Al组的PGC-1αmRNA表达水平分别下降至0.86±0.05（P＜0.05）、0.71±0.05（P＜0.05）和0.63±0.06（P＜0.05），NRF-1mRNA表达水平分别下降至0.80±0.02（P＜0.05）、0.33±0.04（P＜0.05）和0.24±0.04（P＜0.05）， NRF-2mRNA 表达水平分别下降至 0.87±0.02（P＜0.05）、0.83±0.03（P＜0.05）和0.56±0.03（P＜0.05），TFAM mRNA 表达水平分别下降至 0.76±0.03（P＜0.05）、0.60±0.02（P＜0.05）和0.46±0.03（P＜0.05）。<br>　　5、Al对小鼠海马神经FTO、PGC-1α、NFR-1、NRF-2和TFAM蛋白表达水平的影响<br>　　小鼠海马神经元 FTO（F=5.926, P＜0.05）、PGC-1α（F=24.109, P＜0.05）、NFR-1 （F=20.923, P＜0.05）、NRF-2（F=25.223, P＜0.05）和 TFAM（F=7.767, P＜0.05）的蛋白表达水平随着染 Al 剂量的上升而逐渐下降。与对照组（1.00±0.00）相比， 60μmol/LAL 组的 FTO 蛋白表达水平稍有下降（P＞0.5），120 和 240μmol/L Al 组的FTO 蛋白表达水平分别下降至 0.82±0.04 和 0.73±0.14 （ P＜0.05 ）。与对照组（1.00±0.00）相比，60、120 和 240μmol/L Al 组的 PGC-1α蛋白表达水平分别下降至0.86±0.05（P＜0.05）、0.71±0.05（P＜0.05）和0.63±0.06（P＜0.05），NRF-1蛋白表达水平分别下降至0.80±0.09（P＜0.05）、0.59±0.14（P＜0.05）和0.44±0.08（P＜0.05）， NRF-2 蛋白表达水平分别下降至 0.90±0.05 （ P＜0.05 ）、0.78±0.02 和 0.63±0.08 （P＜0.05），TFAM 蛋白表达水平分别下降至 0.57±0.19（P＜0.05）和 0.34±0.20 （P＜0.05)。<br>　　6、染Al后过表达FTO小鼠海马神经元细胞衰老的变化<br>　　与对照组相比，SA-β-gal染色结果显示染Al组和过表达FTO组小鼠海马神经元阳性细胞比例上升；与染 Al 组相比，过表达 FTO+120μmol/L AL 组小鼠海马神经元阳性细胞比例下降。RT-PCR结果显示，染Al后过表达FTO不同组间小鼠海马神经元P16（F=924.647, P＜0.05）、P21（F=181.007, P＜0.05）、HMGA1（F=158.035, P＜0.05）的mRNA表达水平差异显著。与对照组（1.00±0.00）相比，过表达FTO组P16、P21和HMGA1的mRNA表达水平分别下降至0.58±0.02（P＜0.05）、0.84±0.01 （P＜0.05）和0.60±0.03（P＜0.05）。染Al组P16、P21和HMGA1的mRNA表达水平分别为1.78±0.02（P＜0.05）、1.70±0.07（P＜0.05）和1.26±0.02（P＜0.05）。与染 Al 组相比，FTO+120μmol/L Al 组 P16、P21 和 HMGA1mRNA 的表达水平分别下降至1.01±0.02（P＜0.05）、0.47±0.03（P＜0.05）和0.50±0.03（P＜0.05）。<br>　　7、染Al后过表达FTO小鼠海马神经元mtDNA含量和ATP含量的变化<br>　　结果显示，小鼠海马神经元 mtDNA（F=96.966, P＜0.05）和 ATP（F=50.172, P＜0.05）的表达含量差异显著。与对照组（1.00±0.00）相比，过表达 FTO 组小鼠海马神经元mtDNA含量上升至1.28±0.05（P＜0.05）。与对照组（824.10±49.91）相比，过表达FTO组小鼠海马神经元ATP含量大约上升19%（P＜0.05）。与染Al组（0.59±0.06）相比，过表达 FTO+120μmol/L Al 组 mtDNA 含量上升至 0.28±0.04 （P＜0.05）。与染 Al 组（341.38±79.62）相比，过表达 FTO+120μmol/L Al 组的 ATP含量上升49%（P＜0.05）。<br>　　8、染Al后过表达FTO小鼠海马神经元MeRIP-Seq结果<br>　　染 Al 后过表达 FTO 小鼠海马神经元不同组间 PGC-1α（F=761.925, P＜0.05)、NRF-1（F=1493.170, P＜0.5）、NRF-2（F=415.232, P＜0.05）和 TFAM（F=352.116, P＜0.05）甲基化水平的差异显著。与对照组（1.00±0.00）相比，过表达 FTO 组的PGC-1α、NRF-1、NRF-2和TFAM的RNA m6A水平分别下降至0.40±0.03、0.25±0.04、0.60±0.04和0.32±0.02（P＜0.05）。染Al组PGC-1α、NRF-1、NRF-2和TFAM的RNA m6A 水平分别为 2.00±0.06（P＜0.05）、3.04±0.06（P＜0.05）、1.60±0.04（P＜0.05）和1.20±0.04（P＜0.05）。与染 Al 组相比，过表达 FTO+120μmol/L Al 组的 PGC-1α、NRF-1、NRF-2和TFAM的RNA m6A水平分别下降至1.27±0.03（P＜0.05）、2.21±0.03 （P＜0.05）、0.84±0.05（P＜0.05）和0.61±0.02（P＜0.05）。<br>　　9、染Al 后过表达 FTO 小鼠海马神经元 PGC-1α、NRF-1、NRF-2 和 TFAM mRNA表达水平的变化<br>　　结果显示，染Al后过表达FTO不同组间小鼠海马神经元PGC-1α（F=645.419, P＜0.05）、NRF-1（F=848.967, P＜0.05）、NRF-2（F=121.571, P＜0.05）和 TFAM （F=220.963, P＜0.05）的 mRNA表达水平差异显著。与对照组（1.00±0.00）相比，过表达FTO组PGC-1α、NRF-1、NRF-2和TFAM的mRNA表达水平分别上升至1.74±0.05、1.33±0.03、1.30±0.06和1.59±0.04（P＜0.05）。染Al组PGC-1α、NRF-1、NRF-2 和 TFAM mRNA 表达水平分别为 0.64±0.02（P＜0.05）、0.48±0.00（P＜0.05）、0.66±0.04（P＜0.05）和0.76±0.04（P＜0.05）。与染Al组相比，过表达FTO+120μmol/L Al组PGC-1α、NRF-1、NRF-2和TFAM的mRNA表达水平分别上升至0.71±0.02 （P＜0.05）、0.35±0.00（P＜0.05）、0.10±0.03（P＜0.05）和0.29±0.02（P＜0.05）。<br>　　10、染Al后过表达FTO小鼠海马神经元FTO、PGC-1α、NRF-1、NRF-2和TFAM蛋白表达水平的变化<br>　　结果显示，染 Al 后过表达 FTO 不同组间小鼠海马神经元 FTO（F=53.619, P＜0.05）、PGC-1α（F=2112.044, P＜0.05）、NRF-1（F=173.141, P＜0.05）、NRF-2 （F=67.323, P＜0.05）和 TFAM（F=58.27, P＜0.05）的蛋白表达水平差异显著。与对照组（1.00±0.00）相比，过表达FTO组的FTO、PGC-1α、NRF-1、NRF-2和TFAM的蛋白表达水平分别上升至 1.24±0.10（P＜0.05）、1.53±0.01（P＜0.05）、1.36±0.06 （P＜0.05）、1.25±0.07（P＜0.05）和1.28±0.04（P＜0.05）。染Al组FTO、PGC-1α、NRF-1、NRF-2 和 TFAM 的蛋白表达水平分别为 0.47±0.07（P＜0.05）、0.59±0.01 （P＜0.05）、0.58±0.04（P＜0.05）、0.60±0.07（P＜0.05）和0.34±0.09（P＜0.05）。与染Al 组相比，过表达 FTO+120μmol/L Al 组 FTO、PGC-1α、NRF-1、NRF-2 和 TFAM的蛋白表达水平分别上升至 0.40±0.05（P＜0.05）、0.33±0.01（P＜0.05）、0.24±0.03 （P＜0.05）、0.23±0.04（P＜0.05）和0.47±0.08（P＜0.05）。<br>　　结论：<br>　　1 Al 可致 P16、P21 和 HMGA1 的 mRNA 表达水平升高。染 Al 组细胞衰老β-半乳糖苷酶染色阳性细胞增多，即细胞发生衰老。<br>　　2 Al 可致小鼠海马神经转录谱与 m6A 甲基化谱发生变化，使 FTO 表达降低，m6A高甲基化；PGC-1α甲基化水平上调，RNA表达水平下降。<br>　　3 Al 致小鼠海马神经元的线粒体生物发生相关调控因子 PGC-1α、NRF1、NRF-2 和 TFAM 的 mRNA 和蛋白表达水平下降，从而抑制了小鼠海马神经元内线粒体的生物发生，使神经元 mtDNA含量下降，ATP合成减少。<br>　　4 FTO 通过 m6A 修饰来调控 PGC-1α 介导的线粒体生物发生可能与 Al 致小鼠海马神经元衰老密切相关。