检索历史 清除

摘要【目的】<br>　　射干来源于鸢尾科植物射干Belamcandachinensis（L.）DC.的干燥根茎，川射干来源于鸢尾科植物鸢尾IristectorumMaxim的干燥根茎，均具有清热解毒，消（祛）痰，利咽之功效。前期通过文献考证发现，川射干具有清热解毒、泻下通便的功效，而射干仅有清热解毒的功效，两者的化学成分种类基本一致，仅在含量上存在差异；在2020版《中国药典》中记载两者的性味归经及功能主治均相同，仅其质量控制成分不一致，射干为次野鸢尾黄素，而川射干为射干苷，且未记载川射干泻下通便的功效。由此推断，射干和川射干可能存在量-效关系的差异，就目前研究而言，未有相关文献明确说明两者的药效物质基础存在差异。本研究以射干和川射干为研究对象，分析射干和川射干体内外成分的差异，并以两药材中存在差异的单体成分为对象，研究其清热解毒作用及其作用机制；建立射干和川射干中7种化合物的HPLC含量测定方法，比较两者主要活性成分含量的差异，进而揭示射干和川射干清热解毒药效物质基础及作用机制的差异，为中医临床应用及质量评价提供科学依据。<br>　　【方法】<br>　　1、对射干和川射干饮片进行质量检测，将符合质量标准的饮片用于下一步研究；建立射干和川射干水煎液浸膏HPLC指纹图谱方法，并通过LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型及AChE活性实验，筛选出射干和川射干活性部位；<br>　　2、采用UPLC-Q-TOF/MS技术建立射干和川射干水煎液浸膏化学成分数据库，通过血清药物化学研究方法对射干、川射干血中移行成分进行分析鉴定，推断代谢产物的代谢途径，结合多元统计分析，比较两者入血前后的差异情况；<br>　　3、采用聚酰胺柱色谱-重结晶法相结合从射干中制备得到鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B单体，并通过LPS诱导RAW264.7细胞炎症模型及AChE活性实验测定其活性，结合WesternBlot实验研究射干及川射干中活性成分的抗炎作用机制；<br>　　4、建立同时测定射干和川射干活性成分（射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄黄素）的HPLC含量测定方法，比较两味药材的含量差异。<br>　　【结果】<br>　　1、建立了同时测定射干和川射干水煎液的HPLC指纹图谱分析方法，射干和川射干水煎液的共有成分为染料木苷、射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素和野鸢尾黄素，同时，射干水煎液中还检测到芒果苷和次野鸢尾黄素，川射干水煎液中还检测到染料木素，其中次野鸢尾黄素为射干水煎液指纹图谱中峰面积较高的特征成分。相似度分析结果显示，射干和川射干水煎液的化学成分基本一致，但各成分的峰面积差异较大，并筛选出5个对两者药效差异影响较大的关键成分，即射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、鸢尾黄素、野鸢尾黄素。射干和川射干乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能抑制细胞TNF-α、IL-6、IL-1β和NO的释放（P＜0.01），并具有剂量依赖性，且具有一定的抑制AChE活性的作用，由于射干和川射干乙酸乙酯部位的化学成分均包含其正丁醇部位，因此，筛选出射干和川射干乙酸乙酯部位均为两者发挥清热解毒活性的主要部位。<br>　　2、采用UPLC-Q-TOF/MS技术对射干和川射干水煎液入血前后的化学成分进行鉴定，从射干水煎液中鉴定得到70个化合物，川射干水煎液中鉴定得到65个化合物，均多为异黄酮类化合物；从射干组大鼠血清中分析鉴定得到34个移行成分，川射干组大鼠血清中分析推测得到37个移行成分，其中29个为共有成分，包括12原型成分，17个代谢产物。多元统计分析及半定量分析结果表明，射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B、野鸢尾黄素等主要成分在射干和川射干水煎液中的含量有明显差异；上述异黄酮类成分在大鼠体内主要以代谢产物形式入血，并且入血后各成分含量有明显差异；且射干水煎液和血清样品中均检测出次野鸢尾黄素，而川射干水煎液和血清样品中未检出。<br>　　3、聚酰胺对鸢尾甲苷A及鸢尾甲苷B有良好的分离纯化效果，优化后的工艺为：上柱样品溶液质量浓度2.0mg·mL-1，吸附0.5h，以水和20%乙醇依次洗脱，并通过重结晶得到鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B单体，经HPLC峰面积归一化法计算其纯度均大于98%；鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B给药浓度在12.5~200μg·mL-1范围内对RAW264.7细胞无抑制作用；与LPS模型组比较，鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B均能抑制细胞中NO、TNF-α、IL-1β、IL-6的释放（P＜0.01），且呈剂量关系；鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B对AChE具有抑制作用；射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素均能上调胆碱能抗炎通路α7nAChR蛋白表达，及下调花生四烯酸通路中COX-2蛋白和NO通路中iNOS蛋白的表达，次野鸢尾黄素下调花生四烯酸通路中COX-2蛋白和NO通路中iNOS蛋白的表达，对胆碱能抗炎通路α7nAChR蛋白表达无明显影响。<br>　　4、建立了射干和川射干中主要活性成分HPLC含量测定方法，射干中射干苷、鸢尾甲苷B、鸢尾甲苷A、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素含量测定结果分别为0.14%~0.49%、0.03%~0.10%、0.12%~0.27%、0.32%~0.59%、0.03%~0.13%、0.26%~0.88%、0.10%~0.41%；川射干中射干苷、鸢尾甲苷B、鸢尾甲苷A、野鸢尾苷、鸢尾黄素、野鸢尾黄素含量测定结果分别为2.95%~7.24%、0.18%~1.13%、0.12%~1.30%、0.15%~0.40%、0.39%~2.57%、0.01%~0.95%，无次野鸢尾黄素成分。射干和川射干中各成分含量差异较大，其中以射干苷含量相差甚大。<br>　　【结论】<br>　　1、射干和川射干水煎液浸膏化学成分基本一致，但两者在含量上存在较大差异；射干和川射干乙酸乙酯部位是发挥清热解毒（抗炎）作用的主要活性部位，且两者的抗炎活性可能存在量-效关系的差异。<br>　　2、初步推测射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素、鸢尾甲黄素A、鸢尾甲黄素B、野鸢尾黄素、次野鸢尾黄素等成分及各成分含量的差异可能是射干和川射干在发挥不同药效作用的原因之一。<br>　　3、获得了鸢尾甲苷A和鸢尾甲苷B的单体，HPLC归一化法显示纯度大于98%，两者具有一定的体外抗炎活性及抑制AChE活性的作用。射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素和野鸢尾黄素的抗炎机制可能与促进胆碱能抗炎通路中α7nAChR的表达，抑制花生四烯酸通路中COX-2及NO通路中iNOS的表达，减少巨噬细胞炎性因子的释放有关；次野鸢尾黄素能抑制花生四烯酸通路中COX-2及NO通路中iNOS的表达，减少促炎性细胞因子的释放，而对胆碱能抗炎通路无明显影响。<br>　　4、射干和川射干中主要活性成分的含量有明显差异，其中以射干苷含量相差甚大，且川射干无次野鸢尾黄素，说明这可能是两者产生功效差异的原因之一。<br>　　综上所述，初步推测射干与川射干的清热解毒（抗炎）药效物质基础为：射干苷、鸢尾甲苷A、鸢尾甲苷B、野鸢尾苷、鸢尾黄素和野鸢尾黄素，但射干的清热解毒（抗炎）药效物质基础中比川射干多了次野鸢尾黄素，并推测射干和川射干的功效差异可能体现在量-效关系上。然而本文仅对单体成分的抗炎作用机制进行研究，后续将通过活性单体成分的配伍拟合，结合动物模型实验，以进一步阐述射干和川射干的功效差异。