检索历史 清除

摘要肿瘤免疫治疗开创了实体瘤治疗的新时代。肿瘤免疫治疗是以患者的自身免疫系统为基础，通过增强机体的抗肿瘤免疫应答，对抗肿瘤逃逸机制从而杀伤肿瘤；肿瘤免疫治疗副作用小，治疗效果明显。近十年来，免疫检查点抑制剂被广泛用于临床治疗，但由于癌症的异质性或不断演变的肿瘤微环境的复杂性，很大一部分的癌症患者任然表现出对检查点抑制剂单药治疗的原发性和获得性耐药，总体治疗反应率仅限于少数病例和肿瘤类型，只有少数患者能长期获益。此外，免疫检查点抑制也仅限于存在于T细胞表面的负调节因子，这限制了它们的效用。因此，需要开发能够恢复和增强T细胞活性的新策略；大量医药企业聚焦于开发细胞内小分子免疫调节剂或协同细胞内免疫治疗靶点来对抗肿瘤，造血祖细胞激酶1 (Hematopoietic progenitor kinase 1, HPK1) 是此类细胞内免疫调节剂的代表之一。<br>　　HPK1 是 Ste20 丝氨酸/苏氨酸激酶的丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase kinase，MAP4K) 家族的成员，也被称为MAP4K1, 主要在造血细胞（例如T 细胞、B细胞、中性粒细胞、树突状细胞和巨噬细胞）中表达，在 T 细胞和 B 细胞中起负调节作用，抑制 HPK1 激酶活性可增强免疫细胞杀伤肿瘤细胞的能力，HPK1是肿瘤免疫学中的一个非常有价值的靶点。到目前为止，还没有HPK1的抑制剂药物成功上市，因此发现结构新颖的HPK1抑制剂具有重要意义。本论文以计算机辅助药物设计为手段，从基于对接的虚拟筛选方法筛选结构新颖的小分子抑制剂、探索苗头化合物的作用机制、苗头化合物的优化、HPK1激酶的选择性抑制机制、HPK1手性抑制剂的选择性抑制机制等角度着手，推进HPK1抑制剂的研究。<br>　　论文第一章总结了 HPK1 激酶的结构、功能、相关信号通路、相关疾病及HPK1抑制剂的研究进展，然后介绍了本论文所用的分子对接、虚拟筛选、常规分子动力学模拟、伞形采样分子动力学模拟、自适应偏置力模拟、自由能微扰分子动力学模拟方法。<br>　　论文第二章通过基于分子对接的虚拟筛选方法结合激酶抑制实验，发现新型的 HPK1 抑制剂。经过 Glide 三个精度的逐级筛选，最终从 Chemdiv 数据库中挑选了39个化合物进行激酶抑制实验。5个化合物的IC50值在2.93±0.09M到14.27±1.07M 之间。对筛选得到的活性最好的化合物 M074-2865 和阳性药Sunitinib与HPK1激酶结合位点叠合，可以看出Sunitinib和M074-2865与HPK1结合的主要位点差异为Sunitinib尾部到达溶剂前沿，而M074-2865几乎都位于口袋里。这可能是Sunitinib和M074-2865对HPK1之间抑制活性差异的原因；后续应用常规分子动力学模拟方法，对虚拟筛选得到的化合物 M074-2865 以及阳性对照药 Sunitinib 和 HPK1 激酶的结合机制进行研究。结合复合物体系平衡分析、结合自由能分析、残基能量分解、氢键分析、结合模式分析方法总结了M074-2865及Sunitinib和HPK1激酶的相互作用机制。结果发现抑制剂占据ATP结合口袋，与铰链区的Glu92和Cys94之间形成氢键相互作用；其中与铰链区的氢键相互作用是抑制剂高抑制活性的关键。最后，考虑将 M074-2865 分子中的苯并己内酰胺的酰胺部分进行开环，使 M074-2865 分子的尾部也能达到溶剂前沿。我们设计并合成出苯胺类、酰胺类、磺酰胺类、脂肪胺类共16个化合物，在每类化合物中，含有哌嗪的化合物在50M时的抑制率均是最高的；3个含有哌嗪的化合物M2, M8和 M12的IC50分别为1.63M, 3.76M 和2.13M, 说明哌嗪对 HPK1 的抑制起到重要作用, 这些分子可以进一步的改造为活性更好的HPK1抑制剂。<br>　　论文第三章通过常规分子动力学模拟和伞形采样分子动力学模拟研究了两个吲唑类抑制剂（XHS和XHV）对HPK1相对JAK1产生选择性差异的原因。用常规分子动力学模拟和残基能量分解研究了抑制剂（XHS和XHV）对HPK1和JAK1的结合差异，结果表明抑制剂XHS与两个激酶的结合的最大差异为哌嗪与HPK1/Asp101和JAK1/Glu966之间的盐桥相互作用差异。而抑制剂XHV 中的对位哌嗪延伸到溶剂前沿，盐桥相互作用消失，HPK1/Ala96, Gly97, Asp101, Ala154和JAK1/Ser961, Gly962, Glu966, Gly1020能量贡献差异使XHV对这两个激酶有中等选择性。随后的伞形采样分子动力学模拟表明，抑制剂XHS从HPK1和JAK1解离过程中PMF的差异是哌嗪部分与激酶的盐桥相互作用的不同所致。抑制剂XHV从HPK1和JAK1解离过程中PMF的差异是由于2-氟-6-甲氧基苯基基团和哌嗪基团与激酶的疏水作用的不同所致。两种抑制剂在HPK1激酶抑制活性的差异主要由于配体 XHV 中的对位哌嗪延伸到溶剂前沿，而配体 XHS 中的哌嗪改变方向与Asp101相互作用，并且U型抑制剂XHS对HPK1的结合优于JAK1是由哌嗪与Asp101上羧基的盐桥作用控制的。这项研究的结果将为合理开发更好选择性的HPK1抑制剂提供有益的建议。<br>　　论文第四章解释了 HPK1 激酶的对映异构体抑制(1R,3S)-ADFC 和(1S,3R)-ADFC 的抑制活性不同的原因。首先，我们通过分子对接得到了两个抑制剂与HPK1激酶的复合物结构。分子动力学模拟和残基能量分解以及氢键分析结果表明，HPK1对(1R,3S)-ADFC和 (1S,3R)-ADFC结合的差异来源于这些残基Glu62, Ala154 和 Asp155 的贡献，主要是 (1R,3S)-ADFC 中的甲酰胺羰基和Asp155的骨架NH之间形成稳定氢键和甲酰胺氨基和Glu62的侧链羰基形成氢键，以及甲基与 Ala154之间的范德华相互作用。随后的自适应偏置力 (adaptive biasing force, ABF)模拟表明 (1R,3S)-ADFC和 (1S,3R)-ADFC的解离路径不同， (1R,3S)-ADFC 解离时需要吸收的能量比 (1S,3R)-ADFC 解离吸收的能量高。我们的研究结果将有助于设计新的潜在的HPK1抑制剂。<br>　　论文第五章：通过第三章的计算得出，U 型骨架结构抑制剂和溶剂区的Asp101形成氢键相互作用或盐桥相互作用可以提高抑制剂对 HPK1的抑制活性和选择性。因此在本工作中，我们以 U 型抑制剂结合 HPK1 的晶体结构作为格点生成结构，格点生成过程中对Glu92和Cys94的氢键进行限制，评估了Glide分子对接方法三个精度对HPK1抑制剂与非抑制剂的区分能力；最终经过Glide SP和XP精度筛选，从Chemdiv数据库中挑选了21个化合物进行ADP-Glo激酶实验。化合物F091-0167的IC50为17.771.54M，接下来我们检索了F091-0167的同系物并最终购买了 4 个化合物测定了抑制活性并分析了它们的对接结合模式。有 3 个同系物 F091-0818、F091-1013 和 F091-0819 的 IC50 值分别为2.740.55M、13.871.87M和1.550.43M。接下来应用分子对接、分子动力学模拟、骨架跃迁以及自由能微扰相对结合自由能计算方法从理论水平对命中化合物F091-0819进行结构优化。结果表明，分子F7, F8, F7-3, F7-12具有很大的潜力成为HPK1的高效抑制剂，为后续的设计改造打下了很好的基础。