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摘要近年来，研究证据表明 Bmi1 通过抑制 p16/Rb 和 p19/p53/p21 信号通路和DNA损伤、减少氧化应激和维持线粒体功能来调节干细胞的自我更新。Bmi1基因敲除小鼠(Bmi1-/-)由于骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)增殖和成骨分化能力降低，呈现骨质疏松表型。Bmi1通过抑制ATM发挥降低DNA损伤反应(DDR)检查点激活的作用，并抑制 CDK4 在骨组织中的表达。Chk2 基因敲除通过阻断DDR通路能够改善Bmi1缺失引起的许多缺陷。然而，Chk2敲除是否能够矫正Bmi1缺失引起的骨质疏松尚未见报道。<br>　　为了验证这一猜想，我们首先利用 Western Blot 方法检测野生型(WT)和Bmi1-/-小鼠椎骨组织中 DDR 通路相关指标证明：Bmi1 基因敲除明显增加骨组织DNA损伤，激活ATM-Chk2-p53的DDR通路，并抑制CDK4在骨组织中的表达。<br>　　为了明确Chk2敲除是否能预防Bmi1缺失引起的骨量丢失，我们利用X线摄影、微CT、总胶原组织化学染色和骨组织计量学比较分析了8周龄WT、Bmi1-/-、Chk2-/-和Bmi1-/-Chk2-/-小鼠腰椎的表型差异。结果证明：骨密度、骨小梁体积、总胶原阳性面积、骨小梁厚度和数量在Bmi1-/-小鼠较WT小鼠明显降低，在Chk2-/-小鼠较WT小鼠明显增加，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠明显增加。这些结果说明，Chk2敲除能够预防Bmi1缺失引起的骨量丢失。<br>　　为了明确 Chk2 敲除预防 Bmi1 缺失导致的骨量丢失是否与成骨细胞骨形成和破骨细胞骨吸收改变有关，我们利用HE 染色、I型胶原(Col-I)免疫组化染色、TRAP 组织化学染色和 Western blot 等方法比较分析四种基因型小鼠腰椎骨组织中成骨及破骨相关指标的变化。结果证明成骨细胞数、Col-I阳性面积、OPN和Runx2蛋白表达水平在Bmi1-/-小鼠较WT小鼠明显降低，在Chk2-/-小鼠较WT小鼠明显增加，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠明显增加。与上述指标相反， TRAP阳性破骨细胞面和RANKL/OPG比值在Bmi1-/-小鼠较WT小鼠明显增加，在Chk2-/-小鼠较WT小鼠明显降低，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠明显降低。这些结果说明 Chk2 敲除通过促进成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞骨吸收，从而发挥缓解Bmi1缺乏引起的骨丢失的作用。<br>　　为了明确Chk2敲除对Bmi1缺失引起的抗氧化酶表达水平的影响，我们通过免疫组化染色、qRT-PCR 和 Western Blot 等方法比较分析了 SOD1 和 SOD2在8周龄四种基因型小鼠椎骨组织中表达水平的变化。结果证明SOD1和SOD2阳性骨细胞百分比、SOD1、SOD2 和 NQO1 mRNA 及 SOD1 和 SOD2 蛋白表达水平在Bmi1-/-小鼠椎骨组织中显著降低，在Chk2-/-小鼠明显增加，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠明显增加。这些结果表明，Chk2敲除能够矫正Bmi1缺失引起的抗氧化酶表达水平降低。<br>　　为了明确Chk2敲除是否能够矫正Bmi1缺乏引起的骨细胞衰老和衰老相关分泌表型(SASP)增加，我们利用免疫组化、qRT-PCR 和 Western blot 等方法比较分析了8周龄四种基因型小鼠腰椎体中骨细胞衰老和SASP相关指标的变化。结果证明：p53、p21 和 IL-1α阳性骨细胞百分比、p53、p21、IL-1α 和 Mmp8 mRNA表达水平和p53、p21和β-gal蛋白表达水平在Bmi1-/-小鼠较WT小鼠显著增加，在Chk2-/-小鼠较WT小鼠显著降低，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠显著降低。这些结果表明，Chk2敲除能够抑制Bmi1缺乏引起的骨细胞衰老化和SASP增加。<br>　　为了明确Chk2敲除矫正Bmi1缺失引起的成骨细胞骨形成降低是否与骨髓间充质干细胞(BM-MSC)增殖、分化和衰老的变化有关，我们从8周龄四种基因型小鼠分离培养BM-MSCs，利用MTT实验、亚甲基蓝、ALP细胞化学染色和衰老相关 β-gal(SA-β-gal)细胞化学染色及图像分析的方法比较分析了 BM-MSCs生长活力、成纤维细胞集落形成单位(CFU-f)、ALP 阳性 CFU-f (CFU-fap)和 SA-β-gal阳性细胞的变化。结果证明：BM-MSCs生长活力、CFU-f和CFU-fap面积在 Bmi1-/-小鼠较 WT 小鼠显著降低，在 Chk2-/-小鼠较 WT 小鼠明显增加，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠明显增加；而SA-β-gal阳性细胞百分比在Bmi1-/-小鼠较WT小鼠显著增加，在Chk2-/-小鼠较WT小鼠明显降低，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠明显降低。这些结果说明Chk2敲除能够通过促进BM-MSC增殖和向成骨细胞分化，抑制其衰老，而发挥矫正Bmi1缺失引起的成骨细胞骨形成能力降低。<br>　　为了明确 Chk2 敲除矫正Bmi1 缺失引起的 BM-MSC 增殖降低和衰老增加是否通过抑制Cdc25a磷酸化激活CDK4，改善细胞周期阻滞有关，我们从8周龄WT、Bmi1-/-、Chk2-/-和Bmi1-/-Chk2-/-小鼠分离培养BM-MSCs，利用流式细胞术检测细胞周期的变化及使用 Western blot 或 CDK4 细胞免疫荧光染色检测CDK4、p-cdc25a和p53蛋白表达水平的变化。结果证明G0/G1期BM-MSCs百分比、p53和p-cdc25a蛋白表达水平在Bmi1-/-小鼠较WT小鼠显著增加，在Chk2-/-小鼠较WT小鼠明显降低，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠明显降低，而S期 BM-MSCs 百分比、CDK4 蛋白表达水平及阳性细胞百分比在 Bmi1-/-小鼠较WT小鼠显著降低，在Chk2-/-小鼠较WT小鼠明显增加，在Bmi1-/-Chk2-/-小鼠较Bmi1-/-小鼠明显增加。这些结果说明：Chk2敲除可能通过抑制cdc25a磷酸化激活CDK4，改善Bmi1缺失引起的细胞周期阻滞。<br>　　本文研究结果证明了 Bmi1 缺失通过激活 P16/ARF, 诱导骨组织氧化应激和DNA损伤，激活ATM-Chk2-p53的DDR通路，增加Cdc25a磷酸化，抑制CDK4，抑制BM-MSC增殖和成骨分化及成骨细胞骨形成，诱导BM-MSCs/骨细胞衰老和 SASP，促进破骨细胞骨吸收，加速老年性骨质疏松的发生，而 Chk2敲除能够通过阻断 DDR 通路，下调p16, 抑制 Cdc25a磷酸化，激活 CDK4，通过下调 p53 抑制氧化应激，促进 BM-MSC 增殖和成骨分化及成骨细胞骨形成，抑制BM-MSCs骨细胞衰老和SASP及破骨细胞骨吸收，发挥预防Bmi1缺失引起的老年性骨质疏松的作用。这些结果为深入了解现有的基于Chk2及其下游重要效应分子在临床骨质疏松防治中的应用以及为研发Bmi1激动剂或Chk2抑制剂作为防治骨质疏松的药物提供了理论和实验依据。本研究阐述了Bmi1缺失在骨质疏松发生及 DNA 损伤检查点通路阻断在预防骨质疏松发生中的作用机制，为骨质疏松的防治提供了新靶标。