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摘要维生素 D 缺乏在世界各地人群普遍存在, 在老年人群尤其普遍。维生素 D缺乏与全因死亡率及多种慢性病的风险增加有关，包括骨质疏松。然而，维生素D3补充对人群的全因死亡率无影响，不能降低老年人骨折风险。我们课题组利用1α-羟化酶基因敲除[1α(OH)ase-/-]的活性维生素D缺乏的小鼠模型研究发现，该小鼠血清 25(OH)D水平正常或高于正常，但这种小鼠呈现早衰，患多种衰老相关疾病，说明防治衰老与衰老相关疾病需用活性维生素 D。我们课题组最近已经证明 1α(OH)ase 杂合敲除小鼠是一个活性维生素 D 缺乏诱导年龄相关的骨质疏松的动物模型，而 p27 基因敲除(p27-/-)小鼠呈现骨石化表型。因此，我们提出：活性维生素D缺乏是否通过上调p27而加速骨质疏松的发生?活性维生素D如何调节 p27在骨髓间充质干细胞(BM-MSCs)中的表达? p27基因敲除是否能够预防活性维生素D缺乏引起的骨质疏松?<br>　　为了明确活性维生素 D缺乏加速骨量丢失是否与 p27在骨组织中上调有关，我们通过比较分析6月龄同窝WT和1α(OH)ase +/-小鼠椎骨的表型差异，结果证实活性维生素D缺乏加速骨量丢失伴有 p27蛋白表达水平上调，但不明显改变p27 mRNA表达水平。与活性维生素 D缺乏一致，VDR缺失也上调 p27蛋白表达水平，不明显改变 p27 mRNA表达水平。<br>　　与活性维生素D缺乏和VDR缺失一致，H2O2处理能够上调p27蛋白在BM-MSCs 中的表达水平和增加其核定位，不明显改变 p27 mRNA 表达水平，而1,25(OH)2D3处理能够矫正H2O2诱导性p27蛋白表达水平上调和其核定位增加。为了明确1,25(OH)2D3是否通过泛素蛋白酶体途径降解p27蛋白，我们用10μM 蛋白合成抑制剂 CHX 或蛋白酶体抑制剂 MG132 处理了对照、H2O2处理和H2O2+1,25(OH)2D3联合处理的hBM-MSCs，检测p27降解速率或p27蛋白累积。结果证明 1,25(OH)2D3能够明显缩短 p27 蛋白降解速率、明显降低 p27 蛋白累积。为了明确活性维生素D通过泛素蛋白酶体降解p27是否经VDR介导，我们在 hBM-MSCs中敲低VDR, 使用 CHX或 MG132处理对照和 VDR敲低的 hBM-MSCs，通过 Western blot、免疫荧光染色和免疫共沉淀方法检测 p27 降解速率或蛋白累积、亚细胞定位和泛素化水平。结果证明：VDR 敲低能够明显延长p27蛋白降解速率，明显增加p27蛋白累积和其核定位，明显降低p27泛素化水平。这些结果表明活性维生素D经VDR介导不仅能够通过蛋白酶体介导的蛋白水解途径触发hBM-MSCs中p27的降解，而且能够减少其核定位。<br>　　鉴于 p27的泛素化受 CDK2依赖性磷酸化的调节，所以，我们检测了活性维生素D是否经VDR介导转录上调CDK2，磷酸化p27，促进p27泛素化降解。结果发现活性维生素D处理明显下调了p27蛋白在hBM-MSCs中的表达水平，但明显上调了 p-p27(Thr 187)及 CDK2 蛋白和 mRNA 表达水平。我们利用生物信息学分析、ChIP-PCR 和荧光素酶报告基因实验证明了活性维生素 D 能够经VDR介导转录上调CDK2，磷酸化p27。<br>　　为了明确 p27作为 VDR下游靶标之一在抑制 hBM-MSCs增殖和成骨分化中的作用，我们在hBM-MSCs单独敲低或过表达、或共同敲低或过表达p27和VDR，利用 MTT、EdU 掺入、ALP 细胞化学染色和 Western blot 等方法比较分析证明：hBM-MSCs增殖活力、EdU阳性细胞百分率、ALP阳性面积及 Runx2和 Osterix蛋白表达水平在 p27敲低的细胞均明显增加，在 VDR敲低的细胞均明显降低，而在 VDR 敲低的细胞同时敲低 p27, 上述指标在不同程度恢复到对照细胞的水平；在p27过表达的细胞均明显降低，在VDR过表达的细胞均明显增加，而在 VDR 过表达的细胞同时过表达 p27, 上述指标在不同程度恢复到对照细胞的水平。这些结果表明p27作为VDR下游靶标之一在抑制hBM-MSCs增殖和成骨分化中起有重要作用。<br>　　为了研究 p27敲除是否能够挽救 1,25(OH)2D 缺乏引起的骨质疏松，我们建立了p27纯合敲除的1α(OH)ase杂合敲除(p27-/-1α(OH)ase+/-)的小鼠，利用Micro-CT扫描、组织化学和免疫组化及骨计量学分析同窝WT、p27-/-、1α(OH)ase+/-和p27-/-1α(OH)ase+/-小鼠椎体的表型差异。结果证明骨密度、小梁骨体积和数量、I 型胶原阳性面积、成骨细胞数、SOD 阳性骨细胞百分比和其蛋白在椎骨组织中的表达水平在p27-/-小鼠均较WT小鼠显著增加，在1α(OH)ase+/-小鼠均较WT小鼠显著降低，而在 p27-/-1α(OH)ase+/-小鼠均较 1α(OH)ase+/-小鼠显著增加。与上述指标相反，小梁骨分离度和破骨细胞面、p16、β-gal、IL-1β和 IL-6 阳性骨细胞百分比、γ-H2A.X、8-OHdG、p16 和 p53 蛋白在椎骨组织中的表达水平在p27-/-小鼠均较WT小鼠显著降低，在1α(OH)ase+/-小鼠均较WT小鼠显著增加，而在 p27-/-1α(OH)ase+/-小鼠均较 1α(OH)ase+/-小鼠显著降低。为了明确 p27敲除是否能够通过防止活性维生素 D缺乏引起的 BM-MSCs骨发生障碍和衰老，我们通过ex vivo培养四种基因型小鼠来源的BM-MSCs, 利用EdU掺入实验、EdU和 ECFAD免疫荧光染色、ALP和 SA-β-gal细胞化学染色及 Western blot等方法比较分析与 BM-MSCs 增殖、分化、氧化应激和细胞衰老相关指标的变化。结果证明：EdU阳性骨细胞百分比、ALP阳性细胞面积、Osterix、Runx2和OPN蛋白表达水平在p27-/-小鼠均较WT小鼠显著增加，在1α(OH)ase+/-小鼠均较WT小鼠显著降低，在 p27-/-1α(OH)ase+/-小鼠均较 1α(OH)ase+/-小鼠显著增加，而ROS水平和SA-β-gal阳性骨细胞百分比在p27-/-小鼠均较WT小鼠显著降低，在1α(OH)ase+/-小鼠均较 WT 小鼠显著增加，在 p27-/-1α(OH)ase+/-小鼠均较1α(OH)ase+/-小鼠显著降低。这些结果说明 p27 敲除能够通过抑制氧化应激、DNA损伤、细胞衰老和 SASP, 促进成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞骨吸收，发挥矫正活性维生素D缺乏引起的骨质疏松中的作用。<br>　　综上所述, 本研究结果说明活性维生素 D 经 VDR 介导转录上调 CDK2，通过磷酸化p27，促进泛素蛋白酶体降解p27，下调p27在BM-MSCs中的表达和活性，从而抑制在骨组织和 BM-MSCs中增加氧化应激、DNA损伤、细胞衰老和 SASP, 促进成骨细胞骨形成，抑制破骨细胞骨吸收，发挥预防骨质疏松中的作用。本研究不仅阐明了活性维生素 D在 BM-MSCs中下调 p27表达及其在预防骨质疏松中的新机制，而且将为 p27 抑制剂药物在防治骨质疏松中的临床应用提供了实验和理论基础。