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摘要肺气肿是慢性阻塞性肺病（COPD）的主要病理改变，表现为肺泡上皮细胞损伤和细胞外基质（ECM）重塑引起的末端细支气管远端气腔的永久性扩大和肺泡壁的破坏。肺泡上皮细胞是肺抵御外部环境的第一道防线，也是香烟烟雾（CS）直接损害的主要靶细胞。自噬的细胞毒性表现为通过吞噬大量的细胞质和细胞器的自我破坏作用引起不可逆转的细胞皱缩，导致细胞功能丧失。CS暴露可诱导肺泡上皮细胞自噬的过度激活，引起肺泡上皮细胞损伤甚至死亡，最终导致肺气肿。在吸烟引起肺气肿的病理改变中，肺泡上皮细胞发生过度自噬触发细胞死亡是导致肺气肿的重要原因，但其具体的分子机制尚不清楚。<br>　　环状 RNA（circular RNA，circRNA）因其独特的共价闭合结构以及不易被核酸外切酶降解的特性，在哺乳动物中含量丰富且稳定表达，是极具潜力的生物标志物。已有研究表明circRNA作为微小RNA（miRNA）的“海绵”在转录后抑制miRNA靶基因mRNA的表达，通过自噬相关基因（ATG）和通路调节调控自噬过程，参与心肌缺血、脑缺血和肿瘤等慢性疾病的发生发展。然而， circRNA与自噬之间的调控关系以及自噬相关circRNA在CS所致肺气肿中的机制有待深入研究。<br>　　因此，本研究通过不同程度吸烟及COPD人群，CS暴露致小鼠肺气肿模型及CSE处理的肺泡上皮细胞体外细胞模型，探讨circRNA_0026344通过miR-21调控 PTEN/ERK通路介导肺泡上皮细胞自噬和凋亡在吸烟所致肺气肿中的作用及分子机制，为寻找吸烟所致肺损伤的早期生物学标志物和发现新的防控措施提供科学线索。<br>　　目的<br>　　探讨circRNA_0026344通过miR-21调控PTEN/ERK通路介导肺泡上皮细胞自噬和凋亡在吸烟所致肺气肿中的作用及分子机制。<br>　　方法<br>　　本研究首先收集非吸烟者、未患COPD吸烟者和吸烟COPD患者肺组织标本及流行病学调查基础资料；qRT-PCR检测miR-21和circRNA_0026344表达水平并进行线性相关分析；Western blot 检测自噬和凋亡相关蛋白 Beclin 1、LC3B、mTOR 和 Clv-Caspase 3 的表达水平以及结合免疫组化染色检测相关通路蛋白PTEN和p-ERK的表达情况。<br>　　其次，将雄性 6-8 周的 BALB/c 小鼠，随机分为 0、100、200 和 300 mg/m3总颗粒物（TPM）的不同香烟烟雾（CS）剂量暴露组，暴露频率为每天 2 次，每次1h间隔4h，持续16w，建立香烟烟雾诱导小鼠肺气肿剂量暴露模型；Hamp;E染色检测肺组织病理情况；qRT-PCR 检测肺组织 circRNA_0026344 和 miR-21的表达情况；Western blot 观察肺组织中自噬、凋亡和通路相关蛋白表达水平。<br>　　最后，利用香烟烟雾抽提物（CSE）处理人原代肺泡上皮细胞（HPAEpiCs）和A549细胞，观察CSE所致肺泡上皮细胞自噬和凋亡发生情况；qRT-PCR检测 circRNA_0026344 和 miR-21 的表达情况；Western blot 检测通路蛋白 PTEN和 p-ERK 蛋白水平变化；免疫荧光原位杂交技术检测 circRNA_0026344 和miR-21 细胞内定位；RNA 下拉实验检测 circRNA_ 0026344 与 miR-21 的结合情况；进一步应用 pcDNA3.0 高表达 circRNA_ 0026344、转染 miR-21 mimic 或inhibitor等干预处理，研究circRNA_0026344通过miR-21调控PTEN/ERK通路在吸烟所致肺泡上皮细胞自噬和凋亡中的作用及分子机制。<br>　　结果<br>　　一、吸烟对人群肺组织miR-21和circRNA_0026344水平及自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路的影响<br>　　结果发现相比于非吸烟者和未患 COPD 吸烟者，吸烟 COPD 患者肺组织Beclin 1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Clv-Caspase 3 和 p-ERK 蛋白水平升高，而 mTOR和 PTEN蛋白水平降低；肺组织miR-21表达水平升高、circRNA_0026344表达水平降低；circRNA_0026344表达水平与miR-21呈负相关关系。说明相比于非吸烟者，吸烟和COPD疾病状态可引起肺组织细胞自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路的激活，且肺组织miR-21表达水平的升高和circRNA_0026344表达水平的降低与吸烟所致COPD病理过程相关。<br>　　二、CS暴露对小鼠肺泡结构和miR-21、circRNA_0026344水平及自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路的影响<br>　　结果发现与对照组相比，CS暴露引起小鼠肺泡壁破坏以及肺泡腔不规则的扩张；肺组织 Beclin 1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Clv-Caspase 3 和 p-ERK蛋白水平升高及 mTOR和PTEN蛋白水平降低；肺组织miR-21表达水平升高而circRNA_0026344表达水平降低。说明在CS慢性暴露引起小鼠肺损伤和肺气肿的进程中，肺组织细胞自噬、凋亡水平增加及 PTEN/ERK 信号通路激活， miR-21 表达水平升高和circRNA_0026344表达水平降低，并具有一定的剂量-效应关系。<br>　　三、CSE处理对肺泡上皮细胞miR-21和circRNA_0026344水平及自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路的影响<br>　　结果发现ProSP-C定位于人原代肺泡上皮细胞和A549细胞细胞质中；CSE引起人原代肺泡上皮细胞和 A549 细胞内 Beclin 1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Clv-Caspase 3 和p-ERK蛋白水平升高，而mTOR和PTEN蛋白水平降低；miR-21表达水平升高而circRNA_0026344表达水平降低；随着CSE浓度增加，细胞凋亡增加。说明CSE处理可引起肺泡上皮细胞自噬和凋亡水平升高，同时引起miR-21表达水平升高、circRNA_0026344 表达水平降低并激活 PTEN/ERK 信号通路，具有一定的剂量-效应关系。<br>　　四、miR-21在CSE所致A549细胞自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路激活中的作用<br>　　结果发现miR-21与PTEN有结合位点；低表达miR-21可以阻滞CSE引起的A549细胞Beclin 1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Clv-Caspase 3和p-ERK蛋白水平升高及mTOR和PTEN蛋白水平降低；阻滞CSE所致A549细胞LC3B表达水平升高及凋亡增加。说明miR-21参与调节CSE所致A549细胞自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路的激活。<br>　　五、circRNA_0026344的鉴定<br>　　结果发现circRNA_0026344的发散性引物仅从cDNA中扩增出预期大小的单一产物，而 gDNA 组相反；且 circRNA_0026344 可以抵抗 RNase R 的消化作用；circRNA_0026344主要分布在细胞质中；circRNA_0026344与miR-21有结合并共定位于细胞质中。说明在A549细胞中，circRNA_0026344表达稳定并与miR-21共定位于细胞质中影响miR-21的功能。<br>　　六、circRNA_0026344在CSE所致A549细胞自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路激活中的作用<br>　　结果发现上调 circRNA_0026344 可以阻滞 CSE 引起的 A549 细胞 Beclin 1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Clv-Caspase 3 和 p-ERK蛋白水平升高及 mTOR和 PTEN 蛋白水平降低；阻滞 CSE 所致 A549 细胞 LC3B 表达水平升高及凋亡增加。说明circRNA_0026344在CSE所致A549细胞自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路的激活中发挥重要作用。<br>　　七、circRNA_0026344调控miR-21在CSE所致A549细胞自噬、凋亡和PTEN/ERK信号通路激活中的作用<br>　　结果发现上调 circRNA_0026344 可以阻滞 CSE 引起的 A549 细胞 Beclin 1、LC3B Ⅱ/Ⅰ、Clv-Caspase 3 和 p-ERK蛋白水平升高及 mTOR和 PTEN 蛋白水平降低；阻滞CSE所致A549细胞自噬体数量及凋亡增加，而上调miR-21则可拮抗上述阻滞效应。说明circRNA_0026344通过miR-21调控PTEN/ERK通路参与CSE所致A549细胞自噬激活和凋亡的过程。<br>　　结论<br>　　CS暴露引起circRNA_0026344表达水平降低而减少对miR-21的吸附，升高的miR-21通过抑制其靶基因PTEN的表达而激活ERK，促进肺泡上皮细胞自噬和凋亡水平的升高，导致肺气肿。表明 circRNA_0026344 通过 miR-21 调控PTEN/ERK通路介导肺泡上皮细胞自噬和凋亡参与吸烟所致肺气肿的过程。<br>　　综上所述，本研究主要发现<br>　　1、CS引起肺泡上皮细胞中circRNA_0026344水平显著降低。<br>　　2、CS引起肺泡上皮细胞自噬和凋亡水平升高。<br>　　3、circRNA_0026344通过miR-21调控PTEN/ERK通路介导肺泡上皮细胞自噬和凋亡参与了吸烟所致肺气肿的过程。