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摘要研究目的：<br>　　过度的炎症反应和之后的心肌细胞损伤（细胞焦亡和凋亡）与脓毒症诱导的心功能障碍密切相关。我们以前的研究发现新型GLP-1R激动剂栀子苷（GE）对肥胖诱导的小鼠心脏炎症具有较强的保护作用。然而GE对脓毒症心肌病相关的心脏损伤的作用尚不清楚。因此本研究聚焦于GE对脓毒症心肌病的保护作用，并在更深层次探究GE发挥保护作用的具体机制，为脓毒症心肌病的临床治疗提出新的可能。<br>　　研究方法：<br>　　细胞实验：首先在原代大鼠心肌细胞中探究脂多糖（LPS）刺激0h，3h，6h和12h后 NLRP3炎症小体的表达，使用RT-PCR和Western Blot技术检测各组细胞中NLRP3炎症小体的mRNA和蛋白表达水平。进而探究GE在原代大鼠心肌细胞中的保护作用，在原代大鼠心肌细胞脓毒症心肌病模型中检测炎症反应、细胞焦亡和凋亡水平的相关指标。<br>　　为进一步明确NLRP3炎症小体在GE治疗脓毒症心肌病中的作用，使用腺病毒在原代大鼠心肌细胞中过表达NLRP3炎症小体，检测细胞焦亡和凋亡水平。为了探究脓毒症心肌病发生过程中GE对氧化应激的作用，在LPS刺激原代大鼠心肌细胞后检测细胞中过氧化氢（H2O2）水平和超氧阴离子（•O2-）水平。接下来在原代大鼠心肌细胞脓毒症模型中检测活性氧（ROS）和NADPH氧化酶表达水平。为了确定ROS与NLRP3炎症小体的关系，在原代大鼠心肌细胞中使用H2O2（200μmol）刺激并检测NLRP3表达，同时检测ROS抑制剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）和吡咯烷二硫代氨基甲酸铵（APDC）在原代大鼠心肌细胞中对NLRP3炎症小体，细胞焦亡和凋亡的作用。为了明确ROS的来源，使用NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘鎓氯化物（DPI）和夹竹桃麻素（Apocynin）、线粒体抑制剂鱼藤酮（Rotenone）和噻吩甲酰三氟丙酮（TTFA）在原代大鼠心肌细胞中探究对NLRP3炎症小体，细胞焦亡和凋亡的作用。<br>　　为了探究ERK信号通路对NADPH p47phox的调控，使用腺病毒在心肌细胞中持续激活ERK，检测原代大鼠心肌细胞中ERK和p47phox的表达。为了进一步探究AMPKα对ERK的调控作用以及在GE对脓毒症心肌病中的作用，使用腺病毒（Ad-shAMPKα2）在原代大鼠心肌细胞中抑制AMPKα，检测ERK、p47phox、NLRP3的表达，并检测心肌细胞焦亡和凋亡水平。为了探究GE激活AMPKα的具体机制，在原代大鼠心肌细胞中使用蛋白激酶 A（PKA）抑制剂H89抑制PKA或使用小干扰RNA（siRNA）敲除人胰高血糖素样肽-1受体（GLP-1R）（siGLP-1R）或由cAMP直接激活的交换蛋白质（EPAC）（siEPAC），检测AMPKα和LKB1的表达。并在阻断GE激活通路后进一步检测NLRP3的蛋白表达和细胞焦亡及凋亡水平。并进一步将GE的保护效果与现有商用GLP-1R激动剂利拉鲁肽相比较，证明GE的治疗效果。<br>　　动物实验：进一步在动物实验中验证已经得到的实验结果，在小鼠脓毒症心肌病模型中检测炎症反应、细胞焦亡和凋亡水平的相关指标。为进一步明确NLRP3炎症小体的作用，使用NLRP3敲除小鼠在体内实验中进一步探究NLRP3炎症小体的作用，模型建立后检测各组小鼠心功能，血清中LDH水平，并检测心肌细胞焦亡和凋亡程度。并在动物实验中继续探究GE对ROS的作用，在脓毒症心肌病小鼠心脏组织中检测ROS和NADPH氧化酶的表达，并检测NADPH氧化酶活性。为了继续探究GE发挥心脏保护作用的具体机制，使用Western Blot在小鼠心脏组织中检测多种信号通路的表达。为进一步明确AMPKα的作用，使用AMPKα敲除小鼠构建脓毒症心肌病模型后检测小鼠心功能，血清中LDH水平，并检测心肌细胞焦亡和凋亡程度。<br>　　研究结果：<br>　　细胞实验：在LPS刺激原代心肌细胞0h，3h，6h和12h后，NLRP3 mRNA和蛋白表达水平均显著升高，而使用GE治疗有效抑制了NLRP3炎症小体的表达。在LPS刺激后，原代大鼠心肌细胞中炎症水平明显升高，心肌细胞发生明显的焦亡和凋亡。使用GE治疗可以有效缓解LPS引起的过度的炎症反应，心肌细胞的焦亡和凋亡。而在原代大鼠心肌细胞中过表达NLRP3后减弱甚至阻断了GE对心肌细胞焦亡和凋亡的保护作用。<br>　　在使用LPS刺激原代大鼠心肌细胞后H2O2的含量明显升高，使用GE处理可以有效抑制H2O2。LPS刺激后心肌细胞中ROS明显增多，GE可以有效清除过多的ROS。在体实验结果同样发现GE可以有效抑制脓毒症心肌病小鼠心脏组织中ROS水平，并抑制心脏组织中NADPH氧化酶的表达和活性。使用H2O2在原代大鼠心肌细胞中引起高ROS水平可以直接促进NLRP3的表达升高。在LPS刺激原代大鼠心肌细胞后使用活性氧清除剂NAC和APDC可以有效提高细胞生存率并有效抑制IL-1β的表达水平。NADPH氧化酶抑制剂DPI和Apocynin具有GE相似的治疗作用，而线粒体复合物I抑制剂Rotenone与线粒体复合物Ⅱ抑制剂TTFA则不具有保护作用。为进一步明确GE对NADPH氧化酶的抑制作用，使用NAC和DPI共同处理原代心肌细胞后发现LPS刺激无法引起NLRP3炎症小体的增多。在原代大鼠心肌细胞中过表达p47phox后发现GE的保护作用明显减弱。<br>　　在原代大鼠心肌细胞中持续性激活ERK后GE对NADPH p47phox的抑制作用减弱，说明GE通过ERK信号通路对NADPH p47phox进行调节。在原代大鼠心肌细胞中使用腺病毒抑制AMPKα后GE对ERK的抑制作用减弱，GE对ROS的清除减弱，同时对细胞焦亡和凋亡的抑制作用显著减弱。在原代大鼠心肌细胞中使用siGLP-1R或siEPAC阻断了GE对AMPKα和LKB1的激活，证明GE通过GLP-1R-EPAC通路激活AMPKα。使用siGLP-1R或siEPAC阻断了GE对NLRP3炎症小体，细胞焦亡和凋亡的抑制作用。更重要的是与目前临床商用GLP-1R激动剂利拉鲁肽相比，GE具有相似的保护作用。<br>　　动物实验：在体实验的研究结果发现脓毒症心肌病小鼠存活率明显降低，心功能发生显著功能障碍，心脏发生严重损伤。小鼠心脏组织中出现明显的炎症反应，心肌细胞发生严重的焦亡和凋亡。使用GE治疗有效挽救了脓毒症心肌病小鼠的心功能，有效缓解了LPS引起的心脏损伤，同时GE治疗有效抑制了小鼠心脏组织中的炎症反应，心肌细胞的焦亡和凋亡。而在探究NLRP3炎症小体的作用时同样发现NLRP3敲除小鼠脓毒症心肌病模型中减弱了GE对心功能和心脏损伤的保护作用，NLRP3敲除后心肌细胞焦亡水平显著降低。探究GE发挥保护作用的具体分子机制时发现脓毒症心肌病模型中AMPKα的表达水平明显降低，而ERK表达明显升高，使用GE处理有效挽救了AMPKα的激活并抑制了ERK的活化。同样在AMPKα敲除小鼠脓毒症心肌病模型中GE的保护作用显著减弱， AMPKα敲除减弱了GE对心功能和心脏损伤的保护作用，心肌细胞发生明显的焦亡和凋亡。<br>　　研究结论：<br>　　实验一：GE在体内、外实验中均能有效抑制LPS引起的炎症反应，心肌细胞焦亡和凋亡，对脓毒症心肌病具有较好的保护作用，并且GE对脓毒症心肌病的治疗作用主要通过抑制NLRP3炎症小体实现。<br>　　实验二：GE可以在体内、外实验中有效抑制LPS引起的ROS的增多，并且GE主要通过抑制NADPH氧化酶来清除过多的ROS，进而抑制NLRP3炎症小体。<br>　　实验三：GE主要通过GLP-1R/cAMP/EPAC/LKB1通路激活AMPKα，并进一步抑制ERK通路发挥保护作用。GE的保护作用与临床商用GLP-1R激动剂相似。