检索历史 清除

摘要卵巢癌（ovarian cancer, OC）是女性生殖系统中死亡率最高的恶性肿瘤。在所有卵巢癌病理类型中，上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancers, EOC）占发病总人数的90%。由于卵巢组织解剖位置较深，发病后症状隐匿、难以早期发现，且卵巢组织成分复杂、治疗手段有限，因此约70%卵巢癌患者发现时即进入晚期，且5年生存率不超过40%。尽管外科手术技术在不断进步，新的化疗药物及靶向药物在不断发展，仍有超过2/3的卵巢癌患者在初始治疗后复发，且进展迅速。因此，积极探讨卵巢癌发生发展的新的分子机制和靶点，并探索更加有效的靶向治疗方案，有利于改善卵巢癌患者的生存与预后。<br>　　Angiomotin（Amot）被称为血管肌动蛋白，最初是在2001年通过酵母双杂交筛选发现的一种血管抑制素结合蛋白，其在调节内皮细胞迁移、参与管状结构形成、细胞增殖及极性等方面有重要作用。Amot有两种拓扑异构体Amot-p130和Amot-p80，由于其N端结构域的不同，Amot-p80调节内皮细胞的管状形成和迁移，而Amot-p130作为一种复杂的骨架蛋白与多种分子相互作用，包括细胞骨架蛋白F-actin、粘附连接蛋白E-cadherin、细胞紧密连接区蛋白、Hippo通路中核心因子LATS、YAP1、TAZ等等。近年来，多个研究发现Amot-p130与肿瘤细胞增殖、侵袭以及转移方面密切相关，但在不同实体肿瘤中其表达情况及具体机制尚有争议。在一些乳腺癌、鼻窦癌等肿瘤中，Amot-p130的过表达对肿瘤的发生发展有明显的促进作用；但在胃癌、非小细胞肺癌中，Amot-p130可能是肿瘤的抑癌因子。Yes相关蛋白1（Yes associated-protein 1，YAP1）是Hippo-YAP1通路的核心效应因子。Amot-p130在肿瘤中的调控机制更多的是在Hippo-YAP1通路中对YAP1起重要正向或负向调控作用，从而在多种实体肿瘤中发挥促癌或抑癌作用。然而，Amot-p130和YAP1在EOC中的表达水平及其临床意义尚未见报道。本研究旨在分析 EOC 中Amot-p130及YAP1表达的临床意义及预后相关性，初步探讨Amot-p130在EOC发病机制中的生物学作用，以期为EOC患者提供新的预后指标及治疗思路。<br>　　第一部分上皮性卵巢癌中Amot-p130和YAP1表达与临床病理特征及预后的相关性<br>　　目的：通过在EOC组织中检测Amot-p130和YAP1的表达情况，分析两者与临床病理特点及预后的相关性，探讨Amot-p130和YAP1表达在EOC患者中诊断和预后的意义。<br>　　方法：收集手术切除的具有完整临床病理信息的EOC组织石蜡标本共100例，同时选取20例正常卵巢组织、30例良性上皮性卵巢肿瘤作为对照组。通过免疫组化染色检测Amot-p130和YAP1在卵巢上皮性癌组织中的表达。回顾性分析Amot-p130和YAP1表达与EOC患者的临床病理资料的关系、Amot-p130和YAP1表达水平的相关性以及两者在EOC患者预后中的作用。<br>　　结果：<br>　　1. 上皮性卵巢癌标本的临床病理特征<br>　　收集手术切除的100例EOC蜡块组织标本，同时收集其临床信息及病理资料。年龄≤50岁患者36例，＞50岁患者64例。其中浆液性癌为最多见的组织类型，共60例，其余包括30例粘液性癌，10例卵巢子宫内膜样癌。根据手术-病理分期，68例患者处于Ⅲ-Ⅳ期，32例为Ⅰ-Ⅱ期。根据组织学分化程度，高级别者37例，低级别者63例。57例患者伴有淋巴结转移，43例患者无淋巴结转移。67例患者为铂敏感者，而33例患者对铂类耐药。患者的生存期从7个月到80个月不等，中位生存期为40.86个月。<br>　　2. Amot-p130和YAP1在上皮性卵巢癌组织中的表达情况<br>　　Amot-p130主要定位于细胞质中。34例EOC标本中Amot-p130呈弱阳性，66例呈强阳性。在低表达的EOC组织中，有16例是浆液性癌， 14例粘液性癌，4例卵巢子宫内膜样癌。在卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中，Amot-p130呈现弥漫性强阳表达（分别为22/30和17/20）。YAP1定位于细胞核和细胞浆中。48例EOC组织呈现YAP1细胞核表达强阳性， 52例呈现胞核低表达。在48例YAP1胞核高表达组里，有33例是浆液性癌，12例粘液性癌，3例卵巢子宫内膜样癌。YAP1在51例组织中胞浆表达阳性。在卵巢良性肿瘤和正常卵巢组织中，YAP1仅呈胞浆弱阳性（良性肿瘤分别为56.7%、正常卵巢组织15%）。<br>　　3. Amot-p130和YAP1表达与EOC患者临床病理特征的相关性<br>　　Amot-p130低表达与较晚的临床分期（FIGOⅢ-Ⅳ期）（P＜0.01）、病理高级别相关（P＜0.001），且与铂耐药高度相关（P＜0.01）。YAP1在51例EOC中胞浆表达阳性，其表达与EOC患者临床病理特征无相关性。YAP1细胞核表达阳性48例，在铂耐药患者中，YAP1细胞核表达阳性者更高（P＜0.001），且在较晚的临床分期及较高的病理级别中，其表达率增高（P＜0.01和P＜0.001）。<br>　　4. EOC中Amot-p130和YAP1蛋白表达的相关性<br>　　Sepearman 相关分析显示， YAP1 胞浆表达与临床病理特点、Amot-p130没有相关性。Amot-p130低表达与YAP1核表达呈负相关关系（r=-0.240，P＜0.05）。<br>　　5. Amot-p130和YAP1蛋白联合表达表达与EOC患者临床病理特征的相关性<br>　　按 Amot-p130 和 YAP1 核蛋白表达情况，将 100 例标本分为低Amot-p130/ 高YAP1表达、低Amot-p130/低YAP1表达、高Amot-p130/高 YAP1 表达和高 Amot-p130/低 YAP1 表达四组。统计分析发现， Amot-p130和YAP1蛋白联合表达情况与年龄、组织学类型及淋巴结有无转移均无明显相关性（x2值分别为4.630、1.499、0.3115，P值分别为0.201、0.096、0.957）。Amot-p130和YAP1蛋白联合表达情况与病理分期、病理分级及铂类化疗耐药密切相关，差异有统计学意义（x2值分别为8.220、20.010、12.669，P值分别为0.042、0.000、0.005）。低Amot-p130/ 高YAP1表达组与病理分期、病理分级及铂类化疗耐药密切相关，差异有统计学意义（P＜0.05）。在低Amot-p130/ 高YAP1表达组中，手术-病理分期较晚（Ⅲ-Ⅳ期）、组织分化程度较低（高级别）以及铂类耐药的患者较手术-病理分期早、组织分化程度较高（低级别）以及铂类敏感的患者数量增多。低Amot-p130/低YAP1表达、高Amot-p130/高YAP1表达和高Amot-p130/低YAP1表达与与病理分期、病理分级及铂类化疗耐药均无明显相关性（P＞0.05）。<br>　　6. Amot-p130和YAP1蛋白表达与EOC患者预后的关系<br>　　Kaplan-Meier生存分析显示Amot-p130低表达、YAP1高表达与EOC患者的总体生存率显著相关，与Amot-p130高表达、YAP1低表达的患者相比，总体生存时间较短。然而，YAP1胞浆表达与患者预后无明显相关。进一步以低Amot-p130/ 高YAP1表达、低Amot-p130/低YAP1表达、高Amot-p130/高 YAP1 表达和高 Amot-p130/低 YAP1 表达这四组绘制Kaplan-Meier曲线，经Log-rank检验结果显示，各组生存时间存在差异性，其中低Amot-p130/ 高YAP1表达组生存时间最短（中位生存时间50个月），而高Amot-p130/ 低YAP1表达组生存时间最长（中位生存时间82个月）。<br>　　小结：在EOC组织中， Amot-p130呈低表达， YAP1呈高表达。Amot-p130低表达与YAP1核高表达与手术-病理分期较晚（Ⅲ-Ⅳ期）、组织分化程度较低（高级别）及铂类化疗耐药密切相关。Amot-p130表达与YAP1核表达显著相关。Amot-p130低表达与YAP1高表达的EOC患者预后更差。因此Amot-p130 和YAP1可能为EOC潜在肿瘤标记物，对EOC患者的预后有重要意义。<br>　　第二部分 Amot-p130参与上皮性卵巢癌发病机制的研究<br>　　目的：在体外实验中观察Amot-p130对EOC细胞的增殖、克隆形成能力、侵袭、迁移及对顺铂药物敏感性反应等生长特性的影响，进一步研究Amot-p130和Hippo通路中YAP1蛋白表达的相互作用关系，初步研究探讨Amot-p130在EOC发病机制中的调控作用。<br>　　方法：在第一部分实验中，通过免疫组化方法检测出Amot-p130在EOC组织中呈低表达状态，此部分实验设计为通过慢病毒载体介导Amot-p130基因在卵巢癌细胞中过表达，观察Amot-p130基因对卵巢癌细胞增殖、侵袭迁移及对顺铂药物敏感性反应等特性的影响。另外Western blot检测Amot-p130过表达对Hippo通路中YAP1蛋白表达的调控变化。采用qRT-PCR及Western blot方法检测该基因过表达对上皮-间质转化进程中相关蛋白表达的调控作用。<br>　　结果：<br>　　1. 构建过表达Amot-p130的EOC细胞株<br>　　使用 Amot-p130 过表达慢病毒（ LV-Amot ）和阴性对照慢病毒（LV-Con）分别稳定转染人EOC来源的不同细胞株SKOV3及A2780。实时定量PCR和Western blot结果显示，在SKOV3细胞中，LV-Amot细胞株中Amot-p130 mRNA水平和蛋白表达水平显著高于LV-Con细胞株（P＜0.001）。在A2780细胞中，LV-Amot细胞株中Amot-p130 mRNA水平和蛋白水平与LV-Con细胞株无显著差异（P＞0.05）。在SKOV3细胞中构建过表达Amot-p130基因上调转染效率更高，因此采用SKOV3细胞进行后续功能试验。<br>　　2. Amot-p130过表达对EOC细胞增殖能力的影响<br>　　采用CCK8方法观察过表达Amot-p130对细胞增殖生长的影响。Amot-p130过表达病毒转染细胞观察48、72小时后，Amot-p130过表达组细胞的增殖活性低于对照组（P＜0.05），结果表明Amot-p130过表达可明显抑制SKOV3细胞的增殖能力。<br>　　3. Amot-p130过表达对EOC细胞克隆能力的影响<br>　　克隆形成实验结果显示，Amot-p130过表达组SKOV3细胞克隆形成的数目较对照组明显减少，结果比较差异有统计学意义(P＜0.001)。这表明Amot-p130过表达可有效抑制EOC细胞的克隆形成能力。<br>　　4. Amot-p130过表达对EOC细胞迁移和侵袭能力的影响<br>　　Transwell小室结果表明：在迁移及侵袭实验中，Amot-p130过表达组穿过小室的细胞数较对照组明显减少，结果分析有统计学意义(P＜0.01)。结果提示Amot-p130过表达可降低SKOV3细胞的迁移和侵袭能力。<br>　　5. Amot-p130过表达对EOC细胞顺铂敏感性的影响<br>　　CCK8试验结果显示：随着顺铂浓度的增高，实验组和对照组细胞的增殖抑制率均增高，以Amot-p130过表达组细胞增殖抑制率增高较明显（P＜0.01）。应用GraphPad Prism 8.0统计软件计算结果显示，在药物作用48小时后，Amot-p130过表达组细胞的IC50明显低于对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。使用3μg/ml顺铂浓度处理后 48、72小时，可见Amot-p130过表达组细胞增殖活性显著低于对照组（P＜0.001）。该实验结果表明，Amot-p130过表达可增加SKOV3细胞对顺铂化疗的敏感性，降低铂耐药作用。<br>　　6. Amot-p130过表达对Hippo-YAP1信号通路的调控作用<br>　　Western blot检测结果显示LV-Amot组与LV-Con组中YAP1蛋白的相对表达量为（0.28±0.021）和（0.84±0.013），差异有统计学意义（P＜0.01）。该结果提示Amot-p130过表达可降低YAP1蛋白表达水平，特异性地抑制Hippo-YAP信号通路的活性，从而降低肿瘤的发生发展。<br>　　7. Amot-p130过表达对EOC细胞中上皮-间质转化进程的调控<br>　　qRT-PCR结果显示：Amot-p130过表达可下调Vimentin、Snail mRNA的表达，上调E-Cadherin mRNA表达，结果有统计学意义（ P＜0.05, P＜0.001，P＜0.001）。与之相一致的是，Western blot结果显示，对照组与Amot-p130过表达组Snail蛋白的相对表达量分别为（ 0.78±0.014 ）和（0.36±0.031），差异有统计学意义（P＜0.05）；Vimentin蛋白的相对表达量分别为（0.84±0.022）和（0.24± 0.017），差异有统计学意义（P＜0.01），以及两组中 E-cadherin 蛋白的相对表达量分别为（ 0.17±0.013 ）和（0.81±0.036），差异有统计学意义（P＜0.001）。结果表明，Amot-p130过表达可降低SKOV3细胞中Vimentin、Snail蛋白的表达，上调E-Cadherin蛋白表达。实验结果表明，Amot-p130参与调控并抑制了SKOV3细胞的上皮-间质转化进程。<br>　　小结：<br>　　1. Amot-p130过表达可抑制卵巢癌细胞的增殖能力及克隆形成能力。<br>　　2. Amot-p130过表达可降低卵巢癌细胞的迁移和侵袭能力。<br>　　3. Amot-p130过表达可增加SKOV3细胞对顺铂化疗的敏感性，降低铂耐药作用。<br>　　4. Amot-p130过表达可降低YAP1蛋白表达水平，特异性地降低Hippo-YAP信号通路的活性，从而抑制卵巢癌的发生发展。<br>　　5. Amot-p130参与并抑制了SKOV3细胞的上皮-间质转化进程。<br>　　结论：<br>　　1. 在上皮性卵巢癌中，Amot-p130表达下降，YAP1表达上调，与EOC患者分期晚、分化差及预后差相关。Amot-p130与YAP1核表达在EOC组织中表达呈负相关。Amot-p130 和YAP1有望成为卵巢癌早期诊断指标和重要的预后指标。<br>　　2. Amot-p130参与调控EOC细胞的恶性生物学行为，Amot-p130过表达可抑制细胞增殖、迁移侵袭能力及上皮-间质转化进程，降低铂耐药作用，有可能成为EOC治疗新靶点。<br>　　3. Amot-p130通过抑制YAP1的表达抑制EOC的发生发展，在卵巢癌中是抑癌基因。<br>　　在上皮性卵巢癌组织中，Amot-p130低表达与YAP1核高表达与临床病理特点及预后存在相关性, Amot-p130 和YAP1可作为EOC潜在肿瘤标志物。通过调控Amot-p130基因，在体外实验中证实了Amot-p130参与调控卵巢癌细胞的增殖、迁移侵袭过程、上皮-间质化进程及铂类耐药性，且在Hippo信号通路中起到抑癌作用，从而为EOC的诊断及治疗提供了新的思路和方向。