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摘要胎儿生长受限（Fetal growth restriction, FGR）是妊娠期常见并发症，发生率为5~10%，不仅是导致围产儿患病和死亡的重要原因，而且与成人期疾病的发生有关。子宫胎盘灌注不良是胎儿宫内生长受限的主要胎盘病因，子宫螺旋动脉和胎儿胎盘血管系统是胎盘灌注的重要组成部分。妊娠24周后，胎盘血管形成进入非分支血管生成阶段，终末绒毛逐渐成为胎儿与母体交换的基本单位，而终末绒毛内的胎盘微血管也是衡量胎儿血供的基本指标。<br>　　FGR胎盘病理学检查往往提示终末绒毛内毛细血管减少，是FGR胎盘微血管形成受损的常见表现。越来越多的研究发现胎盘转录组和表观遗传调控机制均存在性别差异性，表现在不同性别胎盘对内环境变化的适应能力不同。与FGR男胎胎盘比较，FGR女胎胎盘低氧诱导的VEGF转录水平增高的机制被阻断从而影响胎盘的血管生成；而男胎胎盘的巨噬细胞活化以及炎症因子的增加相比女胎则更明显。胎盘微血管的形成受血管生成因子、炎症因子、激素、细胞增殖与凋亡状态的影响。因此，本研究第一部分主要研究内容为FGR胎盘微血管密度及相关mRNA及蛋白表达的性别差异性。<br>　　根据DohaD理论，即“健康和疾病的发育起源”学说，人类在早期发育过程中的宫内环境暴露会对组织器官在结构和功能上造成永久性或程序性改变，将影响成年期代谢综合征、心血管疾病、神经系统疾病等慢性非传染性疾病的发生发展。因此，深入透彻的了解胎盘功能，尤其是影响微血管形成、造成胎盘灌注不足的分子机制将为不同性别子代慢性病的宫内起源提供证据。miRNA作为主要表观遗传学调控方式之一，具有组织特异性、性别差异性以及细胞特异性的调控特点。胎盘来源miRNA同样也表现出胎儿性别特异性，参与调节胎盘发育、血管生成、营养物质转运和细胞凋亡、胎儿发育等病理生理过程，并可以通过脐带血实现母体与胎儿间的传递，因此进一步研究不同性别间差异表达的miRNA在胎盘中发挥的潜在作用，可以更好地了解miRNA在FGR胎盘功能障碍中的调控作用机制以及男女胎胎盘在表观遗传学调控微血管生成方面的易感性差别。本研究第二部分主要通过生信分析探讨不同性别FGR胎盘miRNA的差异表达谱及其表观遗传学调控作用。<br>　　本研究第三部分研究表观遗传学调控的内皮细胞生物学功能变化。血管内皮在微血管形成中至关重要。血管内皮细胞借助其不断分裂增生及定向迁移后置入已有血管管壁的能力，在孕中晚期胎盘绒毛内微血管形成过程中发挥着重要作用。内皮细胞增殖和迁移，相互接触，形成管腔，最后招募周细胞和其他细胞类型以稳定新形成的血管。因此，了解内皮细胞在特定miRNA调控条件下的生物学行为将有助于更加深入的理解FGR胎盘微血管发育机制。<br>　　第一部分微血管生成相关mRNA及蛋白在胎儿生长受限胎盘的性别差异性表达研究<br>　　目的：选取发生胎儿生长受限（FGR）的单胎足月初产妇的子面胎盘组织作为研究对象，比较FGR组与正常对照组之间与血管生成相关的mRNAs及增殖凋亡蛋白的表达特征，并初步探讨其性别特异性。<br>　　方法：纳入20例FGR及12例正常出生体重对照组作为研究对象，其中FGR组中包含7例男胎，13例女胎；正常对照组中包含9例男胎， 3例女胎。分别比较各组间胎盘功能及胎盘大小等表型特征；采用免疫组化法比较各组CD34抗体染色强度、微血管密度、增殖能力等；采用qRT-PCR方法检测胎盘血管生成因子等mRNA的各组间表达。<br>　　结果：<br>　　1. 与正常对照组比较，FGR组胎盘功能显著下降，胎盘体积明显缩小。<br>　　2. 胎盘的微血管密度在FGR男女胎胎盘中呈现不同变化，FGR女胎胎盘的微血管密度显著低于正常女胎对照组。<br>　　3. 与正常对照组比较，FGR组Ki67表达显著增加；在FGR男胎胎盘中Ki67染色强度显著强于对照组，Caspase 3的活力则明显下降。<br>　　4. 胎盘血管生成因子、IGF家族、炎症因子等mRNA的表达存在组间差异及性别依赖性。<br>　　小结：FGR的胎盘功能明显下降，男女胎胎盘功能均下降。但胎盘微血管密度以及胎盘基因的显著变化大多发生在女胎胎盘中，提示FGR女胎胎盘对局部微环境变化的敏感性可能高于男胎。<br>　　第二部分 FGR胎盘与正常胎盘miRNA差异表达谱的性别特异性分析<br>　　目的：选取7例FGR组与6例正常对照组胎盘组织进行miRNA测序，获得FGR与对照组显著差异表达的miRNA，并按照新生儿性别分组，进一步探讨miRNA在不同性别FGR胎盘中的表达差异及靶基因的功能分析。<br>　　方法：采用二代高通量测序技术对7例FGR组与6例对照组进行miRNA测序，在严格进行数据过滤和质量控制后进行生信分析。基于差异表达miRNA的筛选条件：1) false discovery rate(FDR)＜0.1；2)|log2 Fold Change|≥1，筛选出各组间显著差异表达miRNA:FGR组男胎vs女胎胎盘，对照组男胎vs女胎胎盘，FGR组女胎vs对照组女胎，FGR组男胎vs对照组男胎。并进行靶基因预测及GO/KEGG功能富集分析。<br>　　结果：<br>　　1. FGR组男胎与FGR女胎胎盘比较，miR518B (log2FC 1.589;P=0.001)在FGR女胎胎盘中表达显著上调。<br>　　2. 对照组男胎与女胎胎盘相比，在女胎胎盘中发现7个显著上调的miRNA （ miR941-1, miR941-2, miR941-3, miR941-4, miR941-5, miR193B, miR490）；在FGR男胎胎盘中有3个miRNA表达显著上调（miR451A, miR372, miR136）。<br>　　3. 在FGR女胎与正常女胎胎盘组织miRNA的差异表达分析中，与对照组比较，FGR女胎胎盘中miR451A (log2FC 1.962;P=0.049) 显著上调，而miR543 (log2FC-1.331;P=0.054) 则显著下调（见表3）；在FGR男胎胎盘中，miR520G的表达较对照组显著上调。<br>　　4. 靶基因预测的GO和KEGG功能富集分析结果显示不同性别FGR胎盘差异表达的miRNA均参与血管生成的生物学过程。<br>　　小结：FGR胎盘与对照组miRNA的差异表达谱均存在性别差异，FGR女胎胎盘中差异表达miR543与miR451A可能参与胎盘血管生成；而FGR男胎胎盘差异表达miR520G可能通过影响内皮细胞迁移等在胎盘微血管形成过程中发挥调节作用。另外，GO和KEGG功能富集分析结果显示差异表达的miRNA可能调控的与血管生成相关的靶基因，参与了许多重要的生物学过程和信号通路，与FGR胎盘病因密切相关。<br>　　第三部分 miR543靶向调控ANGPT2调节人脐静脉内皮细胞生物学行为的体外研究<br>　　目的：验证miR543, miR451A, miR520G在FGR组胎盘和对照组胎盘组织中的差异表达，并通过双荧光素酶报告基因检测验证miR543与靶基因的直接作用机制，体外实验探讨miR543与ANGPT2在调节人脐静脉内皮细胞生物学功能中的作用。<br>　　方法：通过qRT-PCR验证miR543, miR451A, miR520G在FGR及对照组胎盘组织中的差异表达情况，将女胎胎盘中显著下调的miR543作为本研究的目标分子，通过靶基因预测方法获得评分高且与血管生成相关的靶基因ANGPT2, 应用双荧光素酶报告基因检测miR543与ANGPT2的结合位点，获得两者直接作用证据。选择HUVEC作为替代胎盘血管内皮的工具细胞进行生物学功能研究，通过构建ANGPT2过表达质粒，利用细胞转染技术实现ANGPT2在HUVEC的过表达，以及miR543的过表达和敲低表达，培养细胞后进行细胞功能实验观察 miR543/ANGPT2 对HUVEC增殖、迁移、成管等生物学行为的影响。<br>　　结果：<br>　　1. 通过qRT-PCR实验验证， 3个显著差异表达miRNA （ miR543, miR451A, miR520G）在胎盘组织中的表达差异均与高通量测序结果一致。<br>　　2. 双荧光素酶报告基因检测证实miR543与ANGPT2的3‘UTR区域靶向结合，从而负向调控基因表达。<br>　　3. 转染miR543 mimics后，CCK8实验表明HUVEC细胞的增殖能力下降，划痕实验和Transwell细胞迁移实验表明细胞的迁移能力明显削弱，成管能力也显著退化，差异均具有统计学意义（P均＜0.05）。转染ANGPT2过表达质粒或miR543 Inhibitor后，细胞的增殖、迁移和成管能力均显著增强，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。并且，追加miR543 mimics可削弱ANGPT2过表达产生的正向调节作用。<br>　　小结：MiR543在FGR女胎胎盘中显著下调，ANGPT2是miR543的靶基因，两者均参与调控胎盘微血管生成。过表达miR543可以抑制HUVEC细胞的增殖、迁移和成管，诱导胎盘缺血表型；抑制miR543表达以及过表达ANGPT2均能提升HUVEC细胞的增殖、迁移和成管能力，并且上调miR543可削弱ANGPT2对血管内皮细胞的正向调节作用。<br>　　结论：<br>　　1. 体内研究发现，FGR胎盘功能相比对照组下降显著，提示胎盘功能在FGR发病中的作用，且胎盘微血管密度表型及胎盘mRNA均呈现胎儿性别间差异，这可能提示女胎胎盘对微环境变化相较男胎更敏感。<br>　　2. FGR的miRNA差异表达谱也存在胎儿性别间差异，FGR女胎胎盘中miR543表达显著下调和miR451A表达显著上调，可能共同参与胎盘血管生成从而影响胎盘功能。FGR男胎胎盘显著上调miR520G表达可能通过调节血管内皮细胞迁移能力影响胎盘血管形成。因此，miRNA介导FGR胎盘的微血管生成需要考虑到胎儿性别的影响。<br>　　3. 体外研究发现miR543表达下调及ANGPT2过表达均能正向调节HUVEC的生物学行为，增加其增殖、迁移及成管能力。双荧光素酶证实两者的直接作用关系，ANGPT2是miR543的靶基因之一，可能参与女胎胎盘代偿性血管生成。<br>　　综上所述，miR543在女性胎儿FGR的发生发展中发挥着重要的调控作用，有潜力成为女胎发生FGR的分子标记物，ANGPT2作为靶基因可能作为治疗靶点。本研究为产前治疗提供了理论和实验基础，但其通路机制尚不清楚，有待进一步探索。