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摘要间充质干细胞（Mesenchymal stem cells, MSCs）因具有多向分化潜能、免疫调节和旁分泌等能力，被越来越广泛地应用于疾病治疗和组织修复领域，如阿尔茨海默征、帕金森、脊髓损伤、骨关节炎和糖尿病等。然而，基于MSCs的移植治疗在临床应用中依旧面临许多限制，如移植后细胞的快速凋亡以及细胞功能缺失等问题。利用三维培养技术制备的 MSC 细胞球（MSC spheroids）相对于单个 MSC 具有更强的抗凋亡能力，并可以有效维持干细胞的功能，是一种新兴的干细胞移植形式。随着MSC细胞球用于移植治疗的研究不断深入，建立安全有效的细胞球体内示踪和功能调控方法受到了广泛关注。其中，基于超顺磁性氧化铁颗粒（Superparamagnetic iron oxide particles，SPIONs）的细胞标记方法可实现细胞球的磁共振（MRI）示踪和磁场参与的细胞功能调控。Ferumoxytol（FMT）作为FDA批准用于治疗缺铁性贫血的纳米氧化铁注射剂，具有良好的生物安全性，可用于制备磁标记MSCs或磁标记MSC细胞球。但在实际应用中，FMT难以被MSCs主动吞噬，而现有的被动标记方式大多依赖阳离子转染试剂，这极大限制了FMT标记磁性MSC细胞球的临床转化。因此，亟需建立一种简单、安全和高效的FMT制备磁性MSC细胞球方法，并通过MRI示踪技术评估MSC细胞球移植成功性和体内维持时间。该方法的建立对实现MSC细胞球的临床转化具有重要意义。此外，是否可以利用磁场进行磁性MSC细胞球的功能调控也亟需进行新的探索。<br>　　本文中，我们利用自主研发的FMT（瑞存）及仿生水凝胶，建立了一种胞间磁标记MSC细胞球的方法，实现了移植MSC细胞球的体内MRI示踪和细胞功能调控。首先设计了用于胞间磁标记MSC细胞球的仿生水凝胶，并对FMT标记MSC细胞球的各项参数进行了调控与优化，实现了高效的 MSC 细胞球磁标记。随后利用制备的磁性 MSC 细胞球进行了体内MRI示踪应用的探索。进一步利用磁标记MSC细胞球结合梯度静磁场增强了MSCs的血管再生修复能力，并研究了梯度静磁场对磁性 MSC 细胞球成骨/软骨分化功能的影响，为实现MSC细胞球体内功能调控提供了新的方式和思路。主要研究内容包括如下几个部分：<br>　　（1）基于三维培养的MSC细胞球胞间磁标记方法的建立。该方法利用物理微环境可调的仿生水凝胶成功制备了细胞间基质蛋白表达丰富、细胞间相互作用蛋白表达增加、结构紧密完整的MSC细胞球。进一步在MSC细胞成球的过程引入FMT进行标记，通过Perls染色和TEM等方法证实了FMT被负载在细胞球内部并位于细胞间隙，确定了在不引入转染试剂的情况下实现MSC细胞球胞间磁标记的可行性。同时，我们对磁性标记量和磁性MSC细胞球尺寸控制参数进行了调控，制备了具有不同标记量和尺寸的磁性MSC细胞球。最后，对磁性 MSC 细胞球的磁矩测定发现，当磁性 MSC 细胞球直径＞65 μm 时，磁性 MSC 细胞球的磁矩与标记量呈正相关，为磁场参与细胞调控提供了依据。<br>　　（2）胞间磁标记MSC细胞球的生物安全性检测及MRI示踪研究。我们首先通过细胞毒性检测、活死细胞染色、细胞ROS水平和体内细胞凋亡实验验证了标记方法的安全性。进一步对MSCs表型、自我更新、干性因子表达和分化能力进行表征，证实了胞间磁标记MSC细胞球具有与MSC细胞球一样的功能。我们随后对磁性MSC细胞球的体内/外MRI示踪效果进行了评估，体外结果显示磁性MSC细胞球具有明显的T2-MRI信号，并且信号强弱与标记量成正比；体内实验中，我们将磁性 MSC 细胞球移植到小鼠皮下，对细胞移植物进行体内MRI示踪的评估，结果表明在磁性MSC细胞球移植部位可观察到明显的T2暗信号，并且该信号可维持7天以上，提示可通过MRI示踪评估细胞球移植成功性和MSC细胞球在体内维持的时间。<br>　　（3）静磁场增强磁性MSC细胞球促血管再生能力的研究。通过FMT磁标记可赋予MSC细胞球超顺磁性，使其产生对外加磁场的磁响应性。我们实验结果表明，梯度静磁场可以促进磁性MSC细胞球的体外聚集，有效避免大尺寸细胞球制备存在的高凋亡率问题，提高了血管生成因子的表达、增强了血管内皮细胞的迁移及血管形成能力。此外，梯度静磁场作用下的细胞球聚集可以延缓细胞球的结构破坏，延长了其体内维持时间。最后，我们通过小鼠下肢缺血模型验证了磁场作用下的磁性MSC细胞球移植具有更好的治疗效果。<br>　　（4）静磁场促进磁性MSC细胞球成骨/软骨分化的研究。我们对磁性MSC细胞球受外部静磁场刺激下的骨/软骨分化能力做了初步探索。研究发现，在梯度静磁场作用下，磁性MSC细胞球成骨分化后的成骨相关基因表达增高、钙沉积增加明显，表明静磁场参与的MSC细胞球成骨分化能力更强。同时，利用梯度静磁场作用可以加快磁性MSC细胞球聚集速度，降低软骨分化过程的细胞凋亡，提高软骨球的粘多糖分泌，展现出增强的成软骨分化效果。这些结果为利用磁场促进磁性MSC细胞球参与骨/软骨缺损治疗提供了基础。