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摘要第一部分人体退变椎间盘组织中异常miRNA的鉴定及靶基因的预测<br>　　目的：通过比较正常与退变的椎间盘组织中miRNA的表达情况，获取异常表达的miRNA，并对其靶基因进行预测。<br>　　方法：根据患者术前核磁共振影像检查，收集不同Pfirrmann退变等级的椎间盘组织，以退变等级为划分标准分为对照组及退变组。将两组标本分别制作基因芯片初步筛选退变的髓核组织中异常表达的miRNA，通过实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)对初筛的miRNA进一步分析，选取差异最大的miRNA，然后通过荧光原位杂交(FISH)进一步验证。随后，将基因芯片检测的所有异常miRNA进行基因本体(GO)分析，通过miRanda、TargetScan、RNA22、PicTar和PITA5数据库预测靶向基因，取5种预测结果的交集，从而得到预测的靶向mRNA。将目标靶基因构建野生型及突变型质粒，质粒与异常miRNA共转染培养的髓核细胞，通过检测荧光素酶活性验证miRNA对靶基因的作用，通过western-blot技术检测靶基因蛋白表达水平。通过KEGG pathway数据库寻找异常表达miRNA可能的靶向信号通路，体外转染miRNA及其阴性对照至培养的髓核细胞，通过western-blot技术验证信号通路相关蛋白的表达水平。<br>　　结果：选取了3例椎间盘退变患者的样本及3例正常对照的样本制作了基因芯片，初步筛查显示共有9个上调和11个下调的miRNA满足平均变化倍数超过2倍或者小于0.5倍，且p小于0.05。选取6例椎间盘退变患者的样本及6例正常对照的样本，采用qRT-PCR方法检测20个候选miRNA，其中，miR-760、miR-150、miR-652-5p和miR-141满足平均倍数变化大于2.0或小于0.5，且p值小于0.01，进入下一轮验证。选取50例椎间盘退变患者的样本及43例正常对照的样本，采用qRT-PCR方法检测这4个候选miRNA，miR-760的差异是最明显的，因此作为研究对象。FISH实验也进一步证实了miR-760在退变椎间盘组织中低表达。此外，椎间盘退变患者髓核细胞中miR-760的表达与椎间盘退变分级呈负相关。<br>　　GO分析发现，异常表达的miRNA与椎间盘发育(GO：0008587)、细胞外基质结构成分(GO：0005201)和细胞外相关区域(GO：0044421)密切相关。5个不同数据库计算预测MyD88是miR-760靶向基因，并且MyD88的3''-UTR包含一个miR-760结合位点。荧光素酶活性研究发现，miR-760 mimics抑制了野生型MyD88 3’-UTR的荧光素酶活性，而miR-760 mimics对突变组的荧光素酶素活性无改变。Western-blot研究表明，miR-760抑制了MyD88蛋白的表达。KEGG分析表明，NF-κB信号通路在退变的髓核细胞中是富集的。Western-blot研究表明，转染miR-760 mimics的髓核细胞显著下调了NF-κB信号通路依赖蛋白的表达，而miR-760 inhibitor显著上调了这些蛋白的表达。进一步回复实验表明，MyD88的上调去除了miR-760对依赖蛋白表达的抑制作用。<br>　　结论：miR-760在退变的椎间盘组织中低表达且与退变分级相关；MyD88是miR-760的靶基因，miR-760抑制髓核细胞MyD88/NF-κB信号通路的表达。<br>　　第二部分miR-760对髓核细胞调控的体外实验研究<br>　　目的：探讨miR-760在体外对人髓核细胞增殖、凋亡及蛋白合成的影响。<br>　　方法：人髓核细胞在体外进行培养及传代，分别转染miR-760 mimics、miR-760inhibitor或其阴性对照至培养的髓核细胞，通过Cy3标记miR-760确定转染效果；通过EdU(5-ethynyl-2''-deoxyuridine)细胞增殖实验评估miR-760对髓核细胞增殖的影响；通过流式细胞学检测miR-760对髓核细胞凋亡的影响；通过western-blot及免疫荧光检测 miR-760对髓核细胞 Col Ⅱ、聚集蛋白多糖、MMP13及ADAMTS-5的表达的影响。<br>　　结果：使用Cy3标记miRNA验证了miR-760成功转染。EdU细胞增殖实验证实，miR-760 mimics转染的髓核细胞比对照组表现出更高的增殖能力，而miR-760 inhibitor转染显著抑制了髓核细胞的增殖。流式细胞学证实，miR-760的高表达抑制了髓核细胞的凋亡。Western-blot实验表明miR-760 mimics增加了ColⅡ和聚集蛋白多糖的表达。相反，转染miR-760 inhibitor的髓核细胞显著增加了MMP13和ADAMTS-5的表达。免疫荧光进一步证实了miR-760 mimics增加了ColⅡ的表达，减低了MMP13的表达水平。<br>　　结论：miR-760可促进体外髓核细胞的增殖，抑制髓核细胞的凋亡。同时， miR-760 高表达可促进 Col Ⅱ和聚集蛋白多糖的表达，降低 MMP13 和ADAMTS-5的水平。<br>　　第三部分miR-760对髓核细胞调控的体内实验研究<br>　　目的：探讨miR-760在体内对椎间盘退变、髓核细胞凋亡及蛋白合成的影响。<br>　　方法：选用12周龄C57BL/6小鼠(随机分为4组，每组3只)。使用氯胺酮(100 mg/kg)进行全身麻醉，在透视定位下，从第6尾椎(Co6)到第8尾椎(Co8)进行矢状切口，在第6和第7尾椎(Co6-Co7)之间的区域，使用31-G针头穿刺尾椎椎间盘1.5 mm ，对髓核进行减压，建立小鼠椎间盘退变模型。通过Cy3标记agomiR-760、antagomiR-760和相应的阴性对照，然后分别注射到小鼠椎间盘的Co6-Co7盘。为确定转染效率，在注射后不同时间点(24和72 h) ，采用IVIS 200成像系统对各组进行活体荧光成像。小鼠在建模手术后3天、1周、2周和3周接受注射。治疗后12周处死小鼠，通过X线检查评估小鼠椎间盘退变的情况；小鼠椎间盘退变组织学情况将通过番红O染色评分。小鼠椎间盘制作组织切片，通过免疫荧光染色评估miR-760对髓核蛋白Col Ⅱ及MMP13表达的影响；通过TUNEL染色评估miR-760对髓核细胞凋亡的影响。<br>　　结果：构建小鼠椎间盘退变的模型，荧光图像显示Cy3标记agomiR-760、antagomiR-760和相应的阴性对照成功的注射到小鼠椎间盘的Co6-Co7盘。X线结果显示局部给予agomiR-760的椎间盘显示出较高的DHI%，番红O染色结果显示agomiR-760处理的椎间盘组织学评分较低，这表明agomiR-760有效保护了椎间盘。相反，在接受antagomiR-760治疗的小鼠中，发生了严重的椎间盘退变。免疫荧光实验显示agomiR-760显著增加了Col Ⅱ的表达，而MMP 13的表达下降，使用antagomiR-760处理的小鼠则表现出相反的结果。TUNEL染色显示，agomiR-760处理的小鼠NP细胞凋亡显著减少，antagomiR-760处理的小鼠髓核细胞凋亡明显增多。<br>　　结论：miR-760在体内有效的减轻了椎间盘退变的进展并抑制髓核细胞的凋亡；miR-760可促进髓核细胞Col Ⅱ的表达，抑制MMP 13的表达水平。