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摘要荧光原位杂交（Fluorescenceinsituhybridization，FISH）是一种核酸分子标记和成像检测方法，随着单细胞测序技术的发展成熟，大量新的细胞类型以及亚型被发现，需要采用FISH等检测技术在组织空间上对它们进行识别。现已开发多种适用于RNA检测的FISH技术，如采用单分子荧光探针、单链DNA串联体探针等进行RNA标记和检测，但仍然存在标记信号弱，多轮成像流程复杂耗时等问题。杂交链式反应（Hybridizationchainreaction，HCR）是一种简单高效的功能性核酸扩增技术，由于HCR探针组织穿透能力强、具有信号放大等优点，被广泛应用于FISH检测中。然而，现有的HCR探针存在以下不足：1）可用的探针种类少，目前只有5对HCR探针在FISH检测中得到了较好的应用，很难高效地开展多轮检测，这极大地限制了其在多重RNA检测方面的应用；2）多重杂交流程繁琐，需要重复进行探针杂交、剥离、再杂交，流程非常耗时；3）HCR信号放大能力有限，特别是针对高自发荧光的组织样本检测时，需要使用更高信号放大能力的检测方法。针对以上问题，本文开发了基于杂交链式反应与滚环扩增实现信号级联放大的RNA原位检测方法，主要研究结果如下：<br>　　（1）针对目前可用探针种类少的问题，本研究设计并通过优化筛选出了9对正交触发的HCR探针，并通过二硫键将特定荧光分子偶联在HCR探针上，将其应用于荧光原位杂交实验中可以实现荧光信号的高效放大和去除。后续采用琼脂糖凝胶电泳和原子力显微镜成像的方式评估了HCR探针的正交触发效果，每对探针都能扩增10kb及以上。<br>　　（2）为了证明以上9对HCR探针能有效进行RNA检测，本研究在不同生物样本上进行了测试。首先开发了相应的FISH实验流程，探究了不同触发时间的RNA检测效果，接下来分别检测了细胞样本的外源性、内源性基因以及组织切片上的特定基因，以上实验结果展示了HCR探针应用于FISH检测的准确性和特异性。<br>　　（3）为了更好地将HCR探针应用于组织样本，本研究将其与原位滚环扩增策略结合开发了ISRCA-HCR技术，进一步实现了信号级联放大，并通过细胞样本和组织样本中特定基因的FISH检测实验展示了其标记准确性和特异性。此外，通过对DAT-EGFP转基因小鼠黑质纹状体和腹侧被盖区的多巴胺能神经元进行多重RNA检测，展示了ISRCA-HCR技术在组织空间上实现细胞分型的应用前景。<br>　　综上所述，本研究开发了9对正交触发的HCR探针，通过与原位滚环扩增策略结合、二硫键偶联和化学裂解等方式，实现了检测信号的17倍放大，简化了多重RNA检测的工作流程，为转录组学分析和空间细胞类型分析提供了有效的研究工具。