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摘要目的：免疫治疗在近十年里迅速发展，作为其重要组成部分，嵌合抗原受体（ChimericAntigenReceptor，CAR）T细胞疗法在实体肿瘤的应用中面临诸多困难。基于课题组前期研究，促甲状腺激素受体（ThyroidStimulatingHormoneReceptor，TSHR）可以作为分化型甲状腺癌CAR-T细胞治疗的靶点，但其疗效有待提高。本文旨在探索DPF3基因在不同癌症中的免疫学特征，通过基因编辑构建DPF3基因敲除的TSHR-CAR-T细胞，探索DPF3基因对TSHR-CAR-T细胞各项功能的影响，为增强实体瘤中CAR-T细胞应用提供新方法。<br>　　方法：研究者从多种公共数据平台中提取DPF3的各项表达数据，利用R语言、GraphpadPrism等软件对数据进行分析和可视化。提取、激活人外周静脉血中T细胞后，通过流式细胞术检测T细胞耗竭状态，WesternBlot检测T细胞中DPF3蛋白表达水平。通过分子克隆技术改造CAR序列的核心质粒结构，将其包装成腺相关病毒（Adeno-AssociatedVirus，AAV）及慢病毒。分别采用CRISPR/cas12a联合AAV和CRISPR/cas9联合慢病毒的方式构建TSHR-CAR-T细胞和DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞模型。通过流式细胞术检测模型中CAR阳性细胞的比例，T7核酸内切酶1（T7Endonuclease1，T7E1）实验及扩增子测序检测DPF3基因的敲除效率。通过Fluc细胞毒性实验检测THSR-CAR-T细胞和DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞在不同效靶比中对肿瘤细胞的持续杀伤作用，流式细胞术检测CAR-T细胞与肿瘤细胞进行多轮共培养后CAR阳性细胞比例、CD8+CAR-T细胞比例、CAR-T细胞记忆表型和耗竭指标的变化，利用酶联免疫吸附实验（EnzymeLinkedImmunosorbentAssay，ELISA）检测CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后不同时间段γ干扰素（Interferonγ，IFN-γ）、肿瘤坏死因子α（TumorNecrosisFactorα，TNF-α）和颗粒酶B（GranzymeB，GZMB）的分泌情况。通过转座酶研究染色质可接近性的高通量测序（AssayforTransposaseAccessibleChromatinusingsequencing，ATAC-seq）探究敲除DPF3基因后染色质开放增多区域相关基因的富集通路。利用分子对接预测DPF3蛋白最佳配体构象与结合位点。<br>　　结果：DPF3在肿瘤微环境（TumorMicroenvironment，TME）中与B细胞、CD8+T细胞等免疫细胞具有明显的相关性，与免疫调节基因之间具有显著相关性。DPF3在多种信号转导通路中富集。DPF3在增殖性T细胞和耗竭性CD8+T细胞中表达丰度较高，T细胞中DPF3表达量随T细胞进入耗竭状态而增多。在构建核心质粒后，研究者成功包装AAV及慢病毒。利用CRISPR/cas12a联合AAV构建TSHR-CAR-T细胞和DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞，DPF3基因敲除的效率为59%，CAR阳性细胞的比例分别为18.4%和15.0%。利用CRISPR/cas9联合慢病毒的方式构建的模型，DPF3基因敲除的效率为88.47%，共刺激域为41BB和CD28的TSHR-CAR-T细胞的比例分别为60.1%和51.4%。对于分别具有41BB和CD28共刺激域的TSHR-CAR-T细胞，敲除DPF3基因显著增强了CAR-T细胞的持续杀伤作用；CAR阳性细胞比例和CD8+CAR-T细胞比例显著增高；效应T细胞和效应记忆T细胞比例上升，中央记忆T细胞比例下降；CAR阳性T细胞中耗竭细胞比例显著下降，IFN-γ、TNF-α和GZMB的分泌在不同时间点均显著升高。ATAC-seq结果显示敲除DPF3基因后，染色质可及性增强，增多的蛋白结合位点关联基因主要富集在T细胞受体信号通路中。DPF3蛋白主要的活性结合位点为GLN-312和TRY-309。<br>　　结论：研究者找到与肿瘤免疫密切相关的基因DPF3，通过两种基因编辑方法构建了DPF3基因敲除的TSHR-CAR-T细胞模型，并验证敲除DPF3基因改善了TSHR-CAR-T的耗竭状态，调控了TSHR-CAR-T细胞的记忆表型及细胞因子分泌能力，增强了TSHR-CAR-T细胞对肿瘤细胞的持续杀伤能力。为增强实体瘤中CAR-T细胞治疗应用提供了新的方法和思路。<br>　　第一部分：DPF3免疫学特征分析及T细胞中表达丰度检测<br>　　目的：DPF3作为一种锌指蛋白，参与了多种生理病理过程，并与部分恶性肿瘤的发生发展密切相关。本部分研究旨在探究DPF3在不同癌症肿瘤微环境中的功能作用，分析DPF3与免疫调节基因的相关关系，探究T细胞中DPF3表达水平变化情况。<br>　　方法：从人类癌症基因组图谱（TheCancerGenomeAtlas，TCGA）、UCSCXena数据库、TISCH2（TumorImmuneSingle-cellHub2）数据库、TIMER2等公共数据平台提取了33种癌症中DPF3的各项表达数据，利用R语言、GraphpadPrism等软件对数据分析和可视化。提取、激活人外周静脉血中T淋巴细胞后，通过流式细胞术检测T细胞耗竭状态，WesternBlot检测T细胞中DPF3蛋白表达水平。<br>　　结果：DPF3与肿瘤微环境密切相关，在TME中与B细胞、CD8+T细胞、巨噬细胞等免疫细胞都具有明显的相关性，与各种免疫调节基因之间也具有显著相关性，富集分析显示DPF3基因与T细胞正向分化、组蛋白结合等多种信号通路相关。单细胞测序数据分析显示DPF3在增殖性T细胞和耗竭性CD8+T细胞中表达丰度较高，实验验证人外周静脉血T细胞中DPF3表达量随T细胞进入耗竭状态而增多。<br>　　结论：DPF3与肿瘤微环境、多种免疫细胞、免疫调节基因都密切相关，T细胞中DPF3的表达丰度随T细胞耗竭而增多。DPF3可用于评估免疫治疗疗效，或可成为免疫治疗的新靶点。<br>　　第二部分：DPF3基因敲除TSHR-CAR-T细胞模型构建<br>　　目的：CAR-T细胞免疫疗法作为一种新兴的免疫治疗方法，在实体肿瘤的应用中仍面临诸多挑战。本部分研究旨在通过多种基因编辑的方法改造TSHR-CAR-T细胞，以期提高TSHR-CAR-T细胞在实体肿瘤中的治疗疗效。<br>　　方法：通过分子克隆技术构建CAR序列的核心质粒结构，并利用AAV6/PDF6系统将核心质粒包装成腺相关病毒，利用VSVG/Gag系统将核心质粒包装成慢病毒。激活外周血中的T细胞后，通过电转导转染的方式向T细胞中递送CRISPR/cas12aamp;nbsp;系统，尝试并筛选多种电转程序后，用腺相关病毒感染T细胞。用慢病毒感染T细胞后，通过电转导转染的方式递送CRISPR/cas9系统。通过流式细胞术检测TSHR-CAR-T细胞比例，T7E1实验及扩增子测序检测DPF3基因的敲除效率，以证实DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞模型构建成功。<br>　　结果：利用分子克隆技术成功构建多种核心质粒，成功包装腺相关病毒及慢病毒。CRISPR/cas12a联合腺相关病毒的方式构建TSHR-CAR-T细胞和DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞，DPF3基因敲除的效率为59%，CAR阳性细胞的比例分别为18.4%和15.0%。CRISPR/cas9联合慢病毒的方式构建DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞，DPF3基因敲除的效率为88.47%，共刺激域为41BB和CD28的TSHR-CAR-T细胞中CAR阳性细胞比例分别为60.1%和51.4%。<br>　　结论：研究者提出了两种构建DPF3基因敲除TSHR-CAR-T细胞模型的方法，并成功验证两种构建方法的可行性。<br>　　第三部分：DPF3敲除对TSHR-CAR-T细胞功能影响及机制探索<br>　　目的：CAR-T细胞疗法应用于实体肿瘤治疗时，面临肿瘤抗原丢失、肿瘤微环境呈现免疫抑制状态等困境，使CAR-T细胞在实体瘤中难以充分、持续杀伤肿瘤细胞。本部分研究旨在利用基因编辑成功构建的DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞，探究敲除DPF3基因是否改变TSHR-CAR-T细胞的相关功能。<br>　　方法：通过Fluc细胞毒性实验检测共刺激域为41BB和CD28的THSR-CAR-T细胞和DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞在不同效靶比中对肿瘤细胞的持续杀伤作用，通过流式细胞术检测CAR-T细胞与肿瘤细胞进行多轮共培养后CAR阳性细胞比例、CD8+CAR-T细胞比例、CAR-T细胞记忆表型和耗竭标志物的变化，通过ELISA检测TSHR-CAR-T细胞、DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞与肿瘤细胞共培养后不同时间段IFN-γ、TNF-α和GZMB的分泌情况。通过ATAC-seq探究敲除DPF3基因后染色质开放增多区域相关基因的富集通路。利用分子对接预测DPF3蛋白最佳配体构象与活性结合位点。<br>　　结果：对于分别具有41BB和CD28信号转导域的TSHR-CAR-T细胞和DPF3KO-TSHR-CAR-T细胞，敲除DPF3基因显著增强了TSHR-CAR-T细胞对肿瘤细胞的持续杀伤作用，CAR阳性细胞比例和CD8+CAR-T细胞比例显著增高；效应T细胞和效应记忆T细胞比例上升，中央记忆T细胞比例下降；CAR-T细胞中耗竭细胞比例显著下降，IFN-γ、TNF-α和GZMB在不同时间点的分泌量均显著升高。ATAC-seq结果显示敲除DPF3基因后，染色质可及性增强，增多的蛋白结合位点关联基因主要富集在T细胞受体信号通路中。DPF3蛋白主要的活性结合位点为GLN-312和TRY-309。<br>　　结论：敲除DPF3基因改善了TSHR-CAR-T的耗竭状态，调控了TSHR-CAR-T细胞的记忆表型及细胞因子分泌能力，增强了TSHR-CAR-T细胞对肿瘤细胞的持续杀伤能力。敲除DPF3基因主要影响T细胞受体信号通路。