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摘要前言<br>　　对于输卵管疾病引起的不孕患者，体外受精-胚胎移植（IVF-ET）仍然是目前最主要的治疗方式之一。在引起不孕的输卵管疾病中，输卵管积水是最常见的原因之一。腹腔镜下双侧输卵管近端离断+远端造口术（简称“输卵管结扎术”）是目前预处理输卵管积水的主要方法，被认为可以提高胚胎种植率。临床上，结扎输卵管的手术时机有两种，一种是在取卵前（IVF-ET前）进行输卵管结扎手术，另一种是在取卵后进行输卵管结扎手术，即先进行促排卵取卵、全胚冷冻，待输卵管结扎手术完成后再进行胚胎移植。但是，输卵管结扎术的时机选择仍存在争议，取卵前还是取卵后进行结扎对妊娠结局的影响不明，手术时机的选择缺乏基于辅助生殖助孕结局的数据支持，特别是生育能力比较低下的患者，如何选择输卵管结扎时机，亟需数据辅助医患决策。除此之外，对于已经行输卵管结扎手术的患者，术后何时进行IVF-ET助孕使患者获益最大化，目前也缺乏相关研究。本研究采用历史性和前瞻性结合的队列研究设计，建立因输卵管积水导致不孕的就医患者队列，分析结扎及助孕两个关键步骤的决策与妊娠结局的关系，并结合患者不同特征进行分层分析，从而明确治疗的最佳时机，同时整合临床和组学数据，解析结扎和助孕时机以及结扎术后影响IVF助孕结局的机制，为输卵管积水患者手术治疗及IVF-ET助孕的选择提供临床和分子依据，最终改善其妊娠结局。<br>　　目的<br>　　探讨输卵管积水患者结扎手术时机，挖掘输卵管积水结扎术后IVF-ET助孕最佳时间，并在临床和分子层面综合解析结扎术后不同助孕结局的机制，为临床医生提供治疗决策，使患者获益最大。<br>　　方法<br>　　本研究构建了历史性和前瞻性患者队列，作为回顾性队列，选取了2016年1月至2022年12月在我院接受IVF-ET助孕，且在取卵前或取卵后（且胚胎未移植前）进行腹腔镜下双侧输卵管结扎术预处理积水的患者。从医院电子病历库中导出所需患者的疾病及治疗相关数据，按结扎时机分为两组：（1）“先结扎手术组”：即先行腹腔镜下双侧输卵管结扎术处理积水，后促排卵取卵及胚胎移植；（2）“先取卵组”：即先促排卵取卵获取胚胎并全胚冷冻后，再行输卵管结扎术。分析比较先行输卵管结扎术和先行促排卵取卵的妊娠结局，来探究输卵管积水患者的结扎时机，并采用倾向性评分匹配（PSM）再次验证分析结果。并将两组患者根据年龄分成两个亚组（低龄组，lt;35岁组，及高龄组，≥35岁），再根据卵巢储备功能分成两个亚组（低卵巢储备组及正常卵巢储备组）。在不同亚组人群中再次探讨输卵管积水的结扎时机。<br>　　从上述回顾性队列中选取已行输卵管结扎术并且在术后1年内进行IVF或卵胞浆内单精子显微注射技术（ICSI）助孕治疗的患者。基于分段回归分析，确定出现显著妊娠结局变化的时间节点，根据妊娠结局的时间变化节点和双侧输卵管结扎术后至行IVF/ICSI助孕的时间间隔将研究对象分为3组，即结扎术后1组：患者于结扎术后3个月内行IVF/ICSI助孕；结扎术后2组：术后3-7个月内助孕；结扎术后3组：术后gt;7个月后助孕。比较三组输卵管结扎术后不同时机进行IVF助孕对妊娠结局的影响，并对高龄或卵巢低储备患者进行亚组分析。<br>　　回顾性队列的主要结局指标包括：卵巢反应指标、胚胎实验室指标以及临床妊娠率、活产率、流产率等妊娠结局，最终指标是累积活产率。数据分析采用线性回归和Logistic回归模型，控制变量包括年龄、身体质量指数（BMI）、不孕年限等相关影响因素，采用Beta值、比值比（OR）及95%可信区间（CI）量化治疗时机与妊娠结局关系。<br>　　为进一步探讨输卵管结扎术后不同助孕结局的临床和分子机制，通过构建前瞻性队列，纳入2021年10月至2023年12月行输卵管结扎术的患者，分别在术前、术后1个月、2个月、3个月以及7个月后采集患者卵巢功能和激素水平。主要评估指标包括：通过阴道超声和抽血检查，评估双侧卵巢窦卵泡计数、基础性激素及抗苗勒氏管激素水平。并将患者根据卵巢储备功能（正常卵巢储备组、低卵巢储备组）及年龄段（lt;35岁组、35-39岁组、≥40岁组）进行分层，采用中介效应分析，最终明确输卵管结扎术后不同时间节点助孕结局不同的临床机制。同时重新收集2024年1月至2024年7月输卵管积水患者结扎前后子宫内膜组织，结合基因转录和蛋白表达水平，进一步阐释输卵管结扎术后IVF-ET助孕时机导致助孕结局差异的潜在分子机制。<br>　　结果<br>　　1、结扎决策的探索：本部分共纳入1490例研究对象（先结扎组：976例；先取卵组：514例）。“先结扎组”患者的Gn启动剂量、成熟卵母细胞（MII）率均高于“先取卵组”。而“先取卵组”的获卵数、hCG注射日E2水平、可用D3胚胎数、优质D3胚胎形成率均显著高于“先结扎组”（Plt;0.05）。“先结扎组”患者的血HCG阳性率、多胎妊娠率、临床妊娠率、活产率以及累积活产率却显著高于“先取卵组”，且“先结扎组”患者的流产率低于“先取卵组”（Plt;0.05）。Logistic回归分析显示，与“先结扎”相比，“先取卵”能降低临床妊娠率和活产率（Plt;0.001），而且是早期流产率的风险因素，经过年龄和多因素校正后，仍有显著的统计学差异（Plt;0.05），并且针对临床妊娠和活产的OR值进一步下降，而对早期流产的OR值则增高。上述结果也在基于年龄和不孕年限匹配分析后的样本中得到验证，即输卵管积水患者先结扎能有效提高患者的助孕结局。<br>　　在亚组分析中，高龄“先结扎组”患者的可用囊胚形成率和优质囊胚形成率均优于“先取卵组”，而且，“先结扎组”的血HCG阳性率、临床妊娠率、活产率以及累积活产率也高于“先取卵组”。Logistic回归分析也发现，高龄“先结扎组”患者的临床妊娠结局优于“先取卵组”（Plt;0.001）。然而，在低卵巢储备亚组分析中，两组患者的妊娠结局和卵巢反应等方面并没有显著差异。<br>　　此外，在“先结扎组”与“先取卵组”患者移植卵裂期D3胚胎或囊胚的妊娠结局比较中，“先结扎组”的妊娠结局也均优于“先取卵组”，且“先结扎组”的血HCG阳性率、临床妊娠率、活产率均明显高于“先取卵组”（Plt;0.05）。<br>　　2、结扎术后IVF-ET助孕时机的探索：共纳入976例患者，本部分对输卵管结扎术后不同时间节点IVF-ET助孕结局进行了分段回归分析，发现在结扎术7个月后进行IVF-ET助孕的妊娠率显著低于7个月内，而3个月内的助孕成功率最高。通过组间比较，结扎术后3个内月行IVF助孕的累积活产率和多胎妊娠率均显著高于结扎术后3-7个月或gt;7个月的患者（Plt;0.05）。除此之外，结扎后3个内月行IVF助孕患者的生化妊娠流产率明显低于3个月后的患者（Plt;0.05）。在线性回归分析中，随着结扎术后IVF助孕时间间隔的推移，胚胎实验室指标中可用囊胚形成率和优质囊胚形成率均有下降的趋势（Plt;0.05）。Logistic回归分析也发现，结扎后3个内月行IVF助孕患者的临床妊娠率（OR：0.503，95%CI：0.320,0.789，P=0.003）和活产率（OR：0.487，95%CI：0.314,0.757，P=0.001）均显著高于gt;7个月行IVF助孕患者。<br>　　在高龄患者亚组分析中，结扎后3个月内行IVF助孕的MII率（85.89%）高于3-7个月（81.12%）和gt;7个月的患者（77.19%），而结扎后gt;7个月行IVF助孕的患者的胚胎移植次数显著少于7个月内的患者（Plt;0.05）。与此同时，结扎后3个月内行IVF的生化妊娠流产率（0%）低于3-7个月（6.78%）和gt;7个月行IVF的患者（6.00%）（Plt;0.05），且结扎后7个月内行IVF患者的累积活产率则显著高于7个月后助孕的患者。然而，在Logistic回归分析中，我们并没有发现高龄患者结扎术后不同IVF-ET助孕时间节点能影响患者的妊娠结局。<br>　　在低卵巢储备亚组分析中，卵巢储备功能低下的患者在结扎后3个月内行IVF助孕的活产率（69.23%）显著高于3-7个月（31.88%）和7个月后的患者（48.39%）（Plt;0.05）。线性回归分析发现，随着结扎术后IVF助孕时间间隔的推移，患者的获卵个数、可用D3胚胎数有减少的趋势，而且优质D3胚胎形成率、可用囊胚形成率和优质囊胚形成率均有降低的趋势（Plt;0.05）。但在Logistic回归分析中，却并没有发现不同IVF-ET助孕时间节点对妊娠结局的显著影响关系。<br>　　对于D5/D6囊胚移植的患者，结扎后3个月内行IVF-ET助孕患者的早期流产率（3.77%vs.12.39%vs.21.05%）低于3个月后的患者（Plt;0.05）。而在卵裂期D3胚胎和囊胚移植中，患者的生化妊娠流产率会随着结扎术后IVF时间间隔的延长而增加。<br>　　3、输卵管结扎术后卵巢功能和激素改变对IVF助孕结局影响：回顾性的数据发现，卵巢功能和激素水平随着结扎术后取卵时间的延长，有着显著差异。前瞻性队列数据发现，与结扎术前情况相比，结扎术后1个月、2个月基础FSH水平（9.15±3.20miu/ml、8.48±2.51miu/ml）明显高于术前水平（7.61±2.56miu/ml），但术后1个月、2个月AFC平均个数（13.98±8.30个、15.84±8.77个）则低于术前（20.78±10.29个）。此外，结扎术后1个月AMH值为2.26±1.64ng/ml，显著低于术前2.87±2.04ng/ml（Plt;0.05）。与术前比较，结扎术3个月后FSH、LH、E2水平、AMH值以及AFC均无差异。这些指标在高龄和低卵巢储备功能患者结扎术后的变化趋势是一致的。中介效应分析验证了输卵管结扎术后至IVF助孕时间间隔与助孕结局有直接关联，但卵巢功能和激素水平对这一关联并没有中介效应。<br>　　4、输卵管结扎术后子宫内膜免疫微环境对IVF助孕妊娠结局改善的机制：为进一步挖掘输卵管结扎术后子宫内膜微环境变化对IVF-ET影响的机制，我们对输卵管结扎术前后患者的子宫内膜组织进行了RNAseq和蛋白层面的分析，并发现输卵管结扎术后子宫内膜的CXCL14、CLIC6、FCGBP等基因高表达，而免疫炎症相关信号通路则被抑制。CIBERSORTx免疫细胞成分分析和免疫组化则发现输卵管结扎术后子宫内膜中大量的M2型巨噬细胞浸润。子宫内膜单细胞测序则发现子宫内膜上皮细胞中CXCL14基因高表达，可能与巨噬细胞CXCR4受体存在交互作用，从而维持子宫内膜免疫微环境的稳定，使得输卵管积水结扎术后患者获得更好的IVF-ET助孕结局。<br>　　结论<br>　　1、针对输卵管积水的不孕患者，优先在取卵前进行输卵管结扎，对患者的妊娠结局意义更大，尤其对临床上生育能力低下的高龄患者疗效显著。<br>　　2、输卵管结扎术后7个月内行IVF-ET助孕将有益于患者的妊娠结局，尤其在结扎术3个月内的助孕成功率最高。但这一时机的选择对高龄和卵巢功能减退的人群不适用。<br>　　3、虽然患者实施输卵管结扎术后卵巢功能会存在一过性的损伤，但在术后3个月基本恢复至术前水平。<br>　　4、输卵管结扎术后IVF-ET助孕时间节点不同所导致妊娠结局差异的主要原因是由于子宫内膜免疫微环境的变化，而非患者的卵巢功能或者激素水平改变导致。