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摘要DNA 甲基化作为表观遗传修饰的一种方式，已被广泛报道与许多人类疾病尤其是癌症相关，负责 DNA 甲基化的 DNA 甲基转移酶（DNMTs）参与包括癌症在内的许多疾病相对应的基因表达。DNA 甲基转移酶 3A（DNMT3A）作为主要的酶活性哺乳动物 DNMTs 之一，已经被视为治疗癌症特别是血液恶性肿瘤的重要靶标。B 细胞急性淋巴细胞白血病（B-ALL）是血液恶性肿瘤中的一种，目前治疗 B-ALL 疾病最有效的方式是嵌合抗原受体 T 细胞免疫疗法（CAR-T）治疗，这是一种治疗肿瘤的精准免疫疗法。<br>　　尽管已有文献报道在 CAR-T 细胞中 DNMT3A 的敲除会阻止 T 细胞耗竭并增强抗肿瘤活性，但是在进行基因敲除时，可能会影响到邻近基因的表达或功能，这种影响被称为非特异性影响；基因敲除虽然完全消除了目标基因的表达，但是也可能导致细胞生理功能的显著改变，甚至引发细胞死亡。比如在动物模型中 DNMT3A−/−小鼠在出生后只能存活约 1 个月，会因无法生长而死亡。基因敲除虽然具有强大的基因编辑能力，但在临床应用上可能面临更多的伦理、安全性和技术挑战等问题。因此，在对目标基因进行功能研究时，可以选择基因敲降或者使用抑制剂等方式来探究基因功能，比如使用具有低毒性、高活性和靶点选择性的有前景的抑制剂，这对于新型癌症疗法的开发和抑制机制研究至关重要。<br>　　本研究中我们通过逐步降低 CAR-T 杀伤肿瘤细胞效靶比（E:T）即效应细胞（CAR-T 细胞）与靶细胞（肿瘤细胞）的比例构建体外杀伤耗竭模型，发现在极限压力测试下，CARhigh 细胞群体优先耗竭，利用该耗竭模型，我们利用 RNA 干扰（RNAi）机制设计短发夹（shRNA）并通过慢病毒包装方式将其导入目标细胞从而敲降 CAR-T 细胞中的 DNMT3A 基因，并通过体外杀伤实验验证该靶点效果。但由于制备 shDNMT3A CAR-T 细胞周期较长且得率低，我们选择了针对该靶点的抑制剂 DY-46-2 ，通过将 DY-46-2 加入 CAR-T-Nalm6 杀伤体系中经过 72h 杀伤后计算剩余肿瘤细胞绝对数目，发现该抑制剂加入后 Nalm6 细胞剩余数目显著降低，且 CAR-T 细胞保留更高 CARhigh 水平，提示该抑制剂可能有助于 CAR-T 杀伤肿瘤细胞。<br>　　由于在本研究中是将抑制剂直接加入到 CAR-T、Nalm6 混合体系中，通过先前的文献报道，DNMT3A 基因在 CAR-T 中表达，我们通过蛋白质印迹实验 （Western Blot）验证了该基因在 ALL 细胞系 Nalm6、REH、RS411 中同样表达，所以对于上述出现的在 DY-46-2 加入后肿瘤细胞明显受到抑制的现象是是由于其增强了 CAR-T 细胞的杀伤能力还是因为该抑制剂本身对肿瘤细胞就有天然杀伤作用需要进一步探索。我们通过 CRISPR/Cas9 系统敲除（Knockout） Nalm6 细胞中 CD19 基因获得 CD19-KO Nalm6 细胞，利用 CAR-T 杀伤CD19-KO Nalm6 细胞；此外，利用 T 细胞杀伤 CD19 Nalm6 细胞，两种体外杀伤方式均加入 DY-46-2 ，结果发现经过 72h 杀伤后均出现了肿瘤细胞明显受到抑制的现象，证明该抑制剂对于肿瘤细胞本身存在良好的杀伤效果，并不完全依赖于 CD19 靶点。为探究 DY-46-2 对肿瘤细胞的作用，我们利用其单独处理肿瘤细胞发现 DY-46-2 可以促进其凋亡、抑制增殖、阻滞细胞周期等；通过 RNA-seq 分析结果发现其作用机制可能为激活了 P53 凋亡相关信号通路；此外，通过 Synergy Finder 协同作用网站计算， CAR-T 与 DY-46-2 的联合使用对肿瘤细胞的杀伤存在协同作用，这一现象同样也在 CAR-NK 细胞中证实，即 CAR-NK 与 DY-46-2 联合治疗 B-ALL 也具有协同作用。<br>　　在体内实验中，我们利用重度免疫缺陷小鼠（NSGTM），构建细胞系来源的异体移植肿瘤模型（CDX）模型，通过体外 DY-46-2 预处理 CAR-T 72h 后的治疗方式，发现相比于对照组而言，抑制剂处理的实验组能显著延长小鼠的生存，证明了该抑制剂联合 CAR-T 治疗 B-ALL 在体内也具有良好的治疗效果。<br>　　综上，我们的研究发现在 CD19 CAR-T 治疗 B-ALL 中，加入针对DNMT3A 靶点的抑制剂 DY-46-2 ，不管是在体外还是体内实验中都增强了 CAR-T 的治疗效果。该研究在生物医学领域具有重要意义，其创新性、临床应用价值等方面均表现出显著的优势。 DY-46-2 的使用不仅有助于优化 CAR-T 细胞的功能，并且有望将其应用于更多类型的肿瘤治疗中，特别是那些对传统疗法不敏感的实体瘤从而为更多肿瘤患者带来希望；通过增强 CAR-T 细胞的抗肿瘤能力，还能揭示肿瘤免疫逃逸、T 细胞耗竭等机制，为开发新型免疫疗法提供理论基础；随着对肿瘤免疫机制研究的深入，未来有望实现基于患者个体遗传特征和肿瘤免疫状态的个性化 CAR-T 疗法，进一步提高治疗效果和安全性。随着研究的深入和技术的不断发展，相信 CAR-T 疗法将在更多类型的肿瘤治疗中发挥重要作用。