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摘要蛋白质N末端乙酰化修饰作为真核生物中广泛存在的蛋白质修饰类型之一，可以调控特定底物蛋白的功能。N末端乙酰化修饰由不同种类的N末端乙酰转移酶进行催化。Naa50为N末端乙酰转移酶E的催化亚基，以共翻译修饰的方式对底物蛋白进行N末端乙酰化修饰。课题组前期研究发现naa50-1突变体表现为植株矮缩、不育和主根长度变短等表型，在Naa50基因组的转基因互补实验中，naa50-1的发育缺陷表型得到完全恢复。为了探究Naa50通过对哪些底物蛋白进行乙酰化修饰进而调控植物发育，本研究通过两种策略对其底物进行检测：（1）利用商品化抗体Anti-Acetylmethionine，对含有N末端乙酰化的甲硫氨酸的肽段进行富集，通过质谱鉴定，比较野生型和naa50-1突变体中的差异肽段，获得Naa50的底物蛋白；（2）以AtNaa50.WholeGene::TurboID互补株系为材料，在TurboID的介导下，利用邻近标记技术探究拟南芥Naa50的特异性底物，阐明Naa50识别底物蛋白的规律。以上实验主要得到以下结果：<br>　　1.Anti-Acetylmethionine不能有效富集起始甲硫氨酸被乙酰化的肽段<br>　　为了探究拟南芥Naa50的底物，我们首先尝试利用Anti-Acetylmethionine对野生型和naa50-1突变体中N末端乙酰化甲硫氨酸的肽段进行富集，试图通过对比差异肽段筛选出Naa50的特异性底物。然而，当样品全蛋白经胰蛋白酶酶解、抗体富集和质谱鉴定后，并没有获得有效的质谱检测结果，可能是由于Anti-Acetylmethionine对N末端乙酰化肽段的富集效率低。<br>　　2.利用邻近标记技术筛选出Naa50的特异性底物<br>　　为了进一步探究拟南芥Naa50的特异性底物，在TurboID的介导下，以野生型和AtNaa20.WholeGene::TurboID互补株系幼苗为对照组材料，以AtNaa50.WholeGene::TurboID互补株系幼苗为实验组材料，利用邻近标记技术富集Naa50的特异性底物蛋白。通过不断优化生物素处理浓度和时间，最终选择降低生物素的浓度，延长处理时间，即20μmol·L–1生物素处理幼苗8d，质谱检测后发现，扣除掉对照组的蛋白肽段后，初步筛选到55种Naa50的特异性底物肽段。<br>　　3.拟南芥Naa50识别底物的规律分析<br>　　通过WebLogo3网站对筛选到的Naa50特异性底物蛋白N末端的前20个氨基酸进行氨基酸分布频度的分析，总结Naa50识别底物的规律。结果发现Naa50对起始的甲硫氨酸（M）以及第二位氨基酸主要为谷氨酸（E）和天冬氨酸（D）的肽段进行乙酰化修饰，表明Naa50主要识别前两位是ME和MD开头的氨基酸的规律。<br>　　4.拟南芥mdf突变体与naa50-1突变体具有高度相似的表型<br>　　通过分析筛选到的Naa50的特异性底物，发现了同时具有生物素修饰和N末端乙酰化修饰的剪切因子MDF，并且拟南芥mdf突变体与naa50-1突变体均具有植株矮缩、不育和主根长度变短等高度相似的缺陷表型，推测MDF是Naa50直接调控的底物。<br>　　5.双分子荧光互补实验验证拟南芥Naa50与MDF的相互作用<br>　　利用双分子荧光互补实验对Naa50与MDF之间是否具有相互作用进行验证，通过分别构建Naa50-YFPN、Naa50H115A-YFPN、Naa50Y77F-H115A-YFPN、Naa50H115A-Y127F-YFPN、Naa50Y77F-H115A-Y127F-YFPN载体以及MDFN-YFPC载体，转化农杆菌，共注射烟草后，在烟草叶片下表皮细胞质中观察到YFP荧光信号，并且阳性对照在细胞核与细胞质中均观察到YFP荧光信号，阴性对照YFPN与MDFN-YFPC共注射烟草后未观察到荧光，表明Naa50与MDF具有相互作用，推测Naa50可能通过对MDF进行乙酰化修饰而调控植株发育。<br>　　6.拟南芥Naa50平衡植株生长发育和胁迫响应<br>　　通过对拟南芥野生型和naa50-1突变体生长7d幼苗进行转录组测序分析，发现naa50-1与野生型之间存在表达差异性基因共5614个，包含表达显著上调基因3912个，表达显著下调基因1702个，其中上调基因主要响应病原菌和参与病原菌免疫防御反应，下调基因主要与光合作用、细胞周期与分裂相关，编码核糖体蛋白的mRNA的表达量也明显下调。暗示Naa50作为重要的调控蛋白，具有平衡植株生长发育和逆境胁迫应答的作用。<br>　　综上所述，本研究利用邻近标记技术筛选出Naa50的特异性底物，阐明了Naa50识别底物蛋白的规律，并且发现拟南芥mdf突变体与naa50-1突变体具有高度相似的表型，同时通过双分子荧光互补实验验证Naa50与MDF具有相互作用，推测Naa50可能通过对MDF进行N末端乙酰化修饰而调控植株发育。此外，Naa50作为一个平衡器，对于平衡植株生长发育和逆境胁迫应答必不可少。