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摘要目的：<br>　　探讨牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis，P. gingivalis）感染和激活肿瘤相关成纤维细胞（Cancer-associated fibroblasts，CAFs）进一步调控肿瘤相关巨噬细胞（Tumor-associated macrophages，TAMs）极化从而改变肿瘤微环境（Tumor micro-environment，TME），促进食管癌恶性进展的机制研究。通过挖掘 P. gingivalis 促进 CAFs 活化并诱导 TAMs 向 M2 型极化的潜在分子靶点，为以 CAFs 为靶点调控肿瘤微环境从而影响食管鳞状细胞癌（Esophageal squamous cell carcinoma，ESCC）进程提供理论和实验依据。<br>　　方法：<br>　　1. 通过免疫组织荧光检测感染或未感染 P. gingivalis 的食管癌组织样本中CAFs 活化标志物 α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）的表达情况。根据结果分析 P. gingivalis 感染与 α-SMA 表达水平的相关性，进一步通过生存期探究两者对食管癌恶性进展的影响；<br>　　2. 收集临床 ESCC 患者术后新鲜组织样本，分离和纯化原代 CAFs 和癌旁正常成纤维细胞（Normal fibroblasts，NFs）。通过免疫荧光，Western blot 和qRT-PCR 方法从基因和蛋白层次对提取的原代细胞进行表型鉴定，包括 α-SMA、成纤维细胞活化蛋白（Fibroblast activation protein，FAP）、Vimentin 等成纤维细胞的表型标志物；通过 CCK-8 检测感染 P. gingivalis 后对 CAFs 增殖能力的影响，从基因和蛋白层面检测感染后 CAFs 活化相关标志物的表达，进一步通过对 CAFs 迁移和分泌功能的检测，探究感染 P. gingivalis 后对 CAFs 的表型和功能改变；<br>　　3. 建立 CAFs 细胞和 ESCC 细胞共培养模型，采用 CCK-8、克隆形成等实验检测不同处理的 CAFs 对 ESCC 细胞增殖能力的影响，采用 Wound-healing、Transwell 实验检测不同处理的 CAFs 对 ESCC 细胞迁移和侵袭能力的改变，深入探究经 P. gingivalis 感染后的 CAFs 对 ESCC 恶性进程的影响；<br>　　4. 通过 ELISA、qRT-PCR 和 Western blot 检测 P. gingivalis 感染后 CAFs 中基质细胞衍生因子-1（Stromal cell-derived factor-1，SDF-1）表达水平的变化；构建 CAFs-siSDF-1 细胞株，进一步探索 CAFs 诱导巨噬细胞极化的机制；首先通过免疫组织荧光方法，观察 P. gingivalis 感染与未感染的食管癌患者肿瘤组织中 M2 型巨噬细胞的浸润情况。建立 CAFs 与 THP-1 经佛波酯（Phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA）诱导后的 M0 细胞共培养模型，采用流式细胞术以及qRT-PCR方法检测与不同处理CAFs共培养的TAMs极化情况；<br>　　5. 构建小鼠食管癌皮下荷瘤模型，在 P. gingivalis 感染条件下，通过皮下和腹腔注射 CAFs 去激活剂和巨噬细胞耗竭剂，观察实验各组小鼠的肿瘤体积变化，实验终点收集肿瘤组织进行组织病理学及肿瘤免疫微环境流式分析，阐明P. gingivalis诱导CAFs活化调控TAMs极化的分子机制。<br>　　6. 统计分析：运用 GrapPad Prism 8.3.0 对实验数据进行统计分析。两者之间的相关性分析采用 χ2 检验；两组数据之间的比较采用独立样本 t 检验，三组以上数据之间的比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为具有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1. ESCC 患者肿瘤组织样本免疫组化结果表明，P. gingivalis 感染与 CAFs 活化标志物α-SMA表达呈显著正相关，与患者的生存期呈显著负相关；<br>　　2. 由 ESCC 患者新鲜肿瘤组织样本中分离、纯化得到的原代 CAFs 和 NFs，经鉴定后符合成纤维细胞的生长特性；肿瘤组织来源的CAFs 增殖能力和表型标志物的表达均显著高于 NFs；原代 CAFs 在感染 P. gingivalis 后，其活化标志物α-SMA、Vimentin 和 FAP 的表达水平显著升高，分泌细胞因子（IL-6、TGF-β）能力提高，进而促进CAFs的功能学改变；<br>　　3. 体外共培养实验结果表明，P. gingivalis 感染活化 CAFs 后可显著增强ESCC细胞的增殖、迁移和侵袭能力；<br>　　4. 通过 siRNA 沉默 CAFs 中 SDF-1 的表达证实，P. gingivalis 感染 CAFs 后可显著促进 SDF-1 的分泌；免疫组化结果显示，ESCC 患者 α-SMA 高表达组织中，CD206 高表达的比例为 64.4 %，二者具有显著的正相关；通过 qRT-PCR 和流式结果进一步证实，P. gingivalis 活化 CAFs 诱导 TAMs 向免疫抑制的 M2 型极化，进而诱发机体免疫抑制性肿瘤微环境；<br>　　5. 荷瘤小鼠体内实验结果表明，P. gingivalis 感染组中 CAFs 活化标志物表达水平显著升高，而在感染 P. gingivalis 同时联合使用 CAFs 去激活剂或巨噬细胞耗竭剂后，其表达显著下降；荷瘤小鼠肿瘤浸润淋巴细胞流式分析结果显示， 与对照组相比，P. gingivalis 感染组中调节性 T 细胞（Regulatory T cell，Treg）和 M2 型 TAMs（CD206）比例显著升高，而细胞毒性 T 淋巴细胞（Cytotoxic T cell，CTL）细胞比例显著降低。<br>　　结论:<br>　　在 ESCC 患者肿瘤组织样本中 P. gingivalis 感染与 CAFs 活化标志物 α-SMA的表达呈显著正相关，且 P. gingivalis 感染阳性和高表达 α-SMA 的患者生存期显著降低。本研究通过分离和纯化ESCC患者原代CAFs和NFs进行体外实验，证实 P. gingivalis 感染能够活化原代 CAFs 发生功能学改变，进而增强 ESCC 细胞的增殖、侵袭、迁移等恶性行为。体内实验结果表明，P. gingivalis 感染可显著促进 CAFs 中 SDF-1 的分泌，诱导 TAMs 向 M2 型极化，导致免疫抑制性微环境，从而促进 ESCC 的恶性进展。上述研究结果揭示了 ESCC 微环境中 P. gingivalis 感染、CAFs 活化和 TAMs 极化三者之间的相互调控作用，为开发ESCC的治疗新策略奠定理论基础。