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摘要第一部分 BRCA1 基因沉默联合奥拉帕尼对 MDA-MB-231 三阴性乳腺癌细胞放疗敏感性影响的体外实验研究<br>　　目的<br>　　利用RNA干扰技术沉默MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞BRCA1基因表达，探讨BRCA1基因沉默联合奥拉帕尼对MDA-MB-231三阴性乳腺癌细胞放疗敏感性影响。<br>　　方法<br>　　体外培养MDA-MB-231人三阴性乳腺癌细胞，设计3组靶向BRCA1基因的短发夹RNA（shRNA）序列和一组阴性对照 shNC序列，分别插入慢病毒载体质粒并转染MDA-MB-231细胞，获得3组BRCA1基因沉默的MDA-MB-231稳转株shBRCA1（shBRCA1 #1、#2、#3）、1组空白对照（Control）以及1组阴性对照（NC）。分别采用Western blot 和qRT-PCR 技术检测各组细胞中BRCA1蛋白、BRCA1 mRNA 的表达水平，筛选出 BRCA1 蛋白和 mRNA 表达最低的 shBRCA1细胞用于后续实验。通过MTT实验获得奥拉帕尼对NC和shBRCA1细胞的生长半抑制浓度IC50。将NC和shBRCA1两组细胞分别分成对照组（Vehicle）、单纯放疗组（Vehicle + IR）、奥拉帕尼组（Olaparib）和奥拉帕尼+放疗组（Olaparib +IR），采用CCK-8实验检测各组细胞在接受0或4Gy的射线照射后24h、48h及72h 在 490nm 处的吸光度值（OD）并计算出细胞存活率。将各组细胞经过 0Gy、2Gy、4Gy、6Gy、8Gy梯度照射剂量处理后继续培养1~2周，通过细胞克隆形成实验观察计数并计算出克隆形成率（PE）及细胞存活分数（SF），计算出放射增敏比（SER）。<br>　　结果<br>　　成功构建了 MDA-MB-231 细胞的 BRCA 基因沉默细胞系。Western blot 结果显示NC组和Control组MDA-MB-231细胞BRCA1蛋白的表达无明显差异，但是3组shBRCA1BRCA1的蛋白表达较NC组明显减低，其中shBRCA1 #1序列BRCA1蛋白表达最低。qRT-PCR提示 shBRCA1 #1序列的mRNA表达最低，将 shBRCA1用于后续实验。<br>　　MTT 实验中奥拉帕尼对两组细胞的 IC50 数值分别为 NC 组 56.4ug/mL， shBRCA1组31.5ug/mL。CCK-8实验显示，NC组细胞中Vehicle组和Olaparib组细胞活力逐渐增加，48h后Olaparib组细胞增速放缓；Vehicle+IR组与Olaparib+IR组在24h时细胞活力略下降，随后活力逐渐增加，Olaparib+IR组增加幅度变缓。shBRCA1组中Vehicle组、Olaparib组及Vehicle+IR组细胞活力逐渐增加，在48h时增速放缓，Olaparib+IR组细胞活力逐渐下降。<br>　　细胞克隆形成实验显示：两组细胞经过 4Gy 剂量射线照射后克隆形成数量及大小均较未照射组明显减少，以shBRCA1组细胞中Olaparib处理组减少更加明显。随着照射剂量的增加，48小时后NC和shBRCA1两组细胞的生存率不同程度下降，且在较高照射剂量下（＞4Gy）两组细胞中Olaparib处理组都较Vehicle组下降得更加明显。单纯奥拉帕尼处理组的细胞SER值为1.43，单纯shBRCA1组细胞SER值为1.35，奥拉帕尼联合shBRCA1组细胞SER值为1.68。<br>　　结论<br>　　体外实验显示， BRCA1 基因沉默联合奥拉帕尼在放疗时通过抑制MDA-MB-231乳腺癌细胞的增殖能力来增强其对放疗的敏感性。<br>　　第二部分 BRCA1 基因沉默联合奥拉帕尼对 MDA-MB-231 移植瘤放疗增敏作用的实验研究<br>　　目的<br>　　探讨BRCA1基因沉默联合奥拉帕尼对MDA-MB-231移植瘤的放疗增敏作用，并通过病理学检测进行验证。<br>　　方法<br>　　使用体外实验获得的shBRCA1和NC细胞构建裸鼠的右前肢皮下移植瘤模型（24只/组），再将两组荷瘤鼠随机分成对照组（Vehicle组）、奥拉帕尼组（Olaparib组）、单纯放疗组（Vehicle+IR组）及奥拉帕尼+放疗组（Olaparib+IR组）（6只/亚组），分别给予相应的治疗处理。测量荷瘤小鼠体重、肿瘤尺寸并计算肿瘤体积，绘制体重、肿瘤体积的变化曲线。首次放疗前 48 小时及 4 次放疗完成后 24小时分别行 18F-FETNIM Micro PET/CT 显像，测量肿瘤的最大标准摄取值（SUVmax-tumor）和同一层面的肿瘤对侧脊柱旁正常肌肉组织SUVmax-muscle，计算肿瘤与肌肉的摄取比值TMR、TMR的增长率ΔTMR和SUVmax的增长率ΔSUVmax。<br>　　对各组肿瘤切片分别进行HIF-1α、Caspase-3和PCNA检测，使用Image-Pro Plus 软件对上述指标进行积分光密度值（IOD）的量化分析。采用 SPSS 26.0 和GraphPad Prism 8.3 软件对实验数据进行统计分析。两组之间数据的比较采用独立样本t检验，同一组内治疗前后数据的比较采用配对样本t检验，多组数据比较采用单因素方差分析（ANOVA），在单因素方差分析显示有显著差异的前提下，进一步运用最小显著差异法（LSD）进行组间两两比较。<br>　　结果<br>　　1、MDA-MB-231移植瘤的生长情况<br>　　移植瘤接种成功后，各组移植瘤体积均逐渐增大。NC组中Vehicle组体积增长最快，Olaparib+IR组体积增长最慢，从接种后第16天开始Vehicle组、Olaparib组及Vehicle+IR组移植瘤体积增速加快，Olaparib+IR组增速减缓。shBRCA1组中Vehicle组体积增长最快，Olaparib+IR组体积增长最慢，接种第18天开始Vehicle组、Olaparib组及Vehicle+IR组移植瘤体积增速加快，Olaparib+IR组增速缓慢，显著低于另外3组。此外，shBRCA1组中移植瘤体积增长速度均较NC组低。移植瘤重量也呈现相同的变化趋势。<br>　　2、18F-FETNIM Micro PET/CT 显像<br>　　放疗前，NC组和shBRCA1组内各处理组的SUVmax、TMR组间差异均无统计学意义（P均＞0.05）；放疗后，NC组和shBRCA1组内各处理组的SUVmax、TMR组间差异均具有统计学意义（P均＜0.001）。放疗后，NC组中Vehicle组和Olaparib 组 TMR 均较放疗前增加，ΔTMR 分别为 49.18%、27.65%；Vehicle+IR组与Olaparib+IR组TMR值均较放疗前减低，ΔTMR分别为-18.36%、-32.05%。shBRCA1组中Vehicle组TMR较放疗前增加，ΔTMR为45.75%；其余各组TMR均较放疗前减低；shBRCA1 组中 Olaparib+IR 组 TMR 值显著低于 NC 组中Olaparib+IR组（P＜0.01）。<br>　　3、病理学分析<br>　　HIF-1α：NC组和shBRCA1组内各处理组肿瘤组织HIF-1α的平均积分光密度值（IOD）差异均有统计学意义（P均＜0.001）。两组移植瘤模型的Olaparib+IR亚组之间HIF-1α的平均IOD值差异有统计学意义（P＜0.001）。<br>　　Caspase-3：NC组和shBRCA1组内各处理组肿瘤组织Caspase-3的IOD组间比较差异均有统计学意义（P 均＜0.001）。两组移植瘤的 Olaparib+IR 亚组之间Caspase-3的平均IOD值差异有统计学意义（P＜0.01）。<br>　　PCNA：NC组和shBRCA1组内各处理组肿瘤组织PCNA的IOD值组间比较差异均有统计学意义（P均＜0.001）。两组移植瘤的Olaparib+IR亚组之间PCNA的平均IOD值差异有统计学意义（P＜0.001）。<br>　　结论<br>　　18F-FETNIM PET/CT 显像能有效监测移植瘤内乏氧变化情况，BRCA1基因沉默联合奥拉帕尼对MDA-MB-231性乳腺癌移植瘤的放疗有明显的放射增敏作用。