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摘要背景和目的<br>　　糖尿病足溃疡（Diabetic foot ulcer, DFU）是糖尿病的严重并发症，在糖尿病患者中具有较高的发病率、复发率、致残率和致死率。负压伤口治疗（Negative pressure wound therapy, NPWT）是DFU的重要辅助治疗手段，但其促进创面愈合的分子机制研究仍处于初步阶段。RNA N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine, m6A）甲基化是重要的表观遗传调控途径，并参与糖尿病创面愈合的病理生理过程。肾母细胞瘤1相关蛋白（Wilms tumor 1-associated protein, WTAP）是m6A甲基转移酶的核心组分，参与调节m6A甲基化在细胞核中的定位与功能。本研究旨在探讨WTAP通过介导m6A甲基化在NPWT过程中促进DFU愈合的作用及其临床意义，探索其对角质形成细胞功能的影响，以揭示DFU的表观遗传学机制，为寻找潜在的治疗靶点提供了新的理论依据。<br>　　方法<br>　　本研究根据纳入及排除标准最终纳入自2023年12月至2024年10月在医院内分泌代谢科住院进行NPWT的DFU患者46例（DFU组）。同时，研究纳入了同期在医院烧伤科住院进行NPWT的非糖尿病下肢慢性皮肤溃疡患者16例（SUC组）。DFU组和SUC组患者NPWT疗程均为1周。将DFU组中NPWT前的患者归入DFU前组，NPWT后的患者归入DFU后组；将SUC组中NPWT前的患者归入SUC前组，NPWT后的患者归入SUC后组。收集DFU组和SUC组患者的一般资料、实验室检查结果以及NPWT前后的创缘皮肤组织标本，并随访NPWT结束后 4周两组患者创面愈合情况。采用定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, qRT-PCR）、Western Blot测定创缘皮肤组织中WTAP及甲基转移酶样蛋白3（Methyltransferase like protein 3, METTL3 ）、甲基转移酶样蛋白14 （ Methyltransferase like protein 14, METTL14）的相对表达量；采用免疫组化法观察创缘皮肤组织切片中WTAP的表达情况；采用比色法检测创缘皮肤组织中RNA m6A甲基化总水平，计算观察指标NPWT前后的相对改变量（Δ值）。将DFU组与SUC组NPWT前后WTAP mRNA的Δ值（ΔWTAP）的中位数作为分割点，小于或等于中位数者为低表达变化组，大于中位数者则为高表达变化组，比较低表达变化组与高表达变化组间DFU临床特征及治疗结局的差异。建立体外细胞高糖模型，通过siRNA敲低人永生化角质形成细胞（Human immortal keratinocyte line, HaCaT）中WTAP表达，采用qRT-PCR检测细胞WTAP mRNA表达，采用CCK8、划痕实验检测HaCaT细胞增殖、迁移能力变化。统计数据分析使用SPSS 27.0软件，以P＜0.05为差异具有统计学意义。<br>　　结果<br>　　1. 对所纳入的46例DFU患者和16例SUC患者NPWT前的一般临床资料及实验室指标进行统计学描述和比较。46例DFU患者中，男性24例，女性22例，年龄18~79岁，平均年龄62.94岁，糖尿病平均病程12.13年，溃疡中位病程30天；16例SUC患者中，男性8例，女性8例，年龄35~76岁，平均年龄55.75岁，溃疡中位病程30天。对两组数据进行比较，与SUC组相比，DFU组的体质指数（Body mass index, BMI）、红细胞计数（Red blood cell count, RBC）、血红蛋白（Hemoglobin, Hb）、红细胞比容（Hematocrit, HCT）、血清白蛋白（Serum albumin, ALB）、总胆固醇（Total cholesterol, TC）、估算的肾小球滤过率（Estimated glomerular filtration rate, eGFR）均显著下降（P＜0.05）；与SUC组相比，DFU组的空腹血浆葡萄糖（Fasting plasma glucose, FPG）、糖化血红蛋白（Glycated hemoglobin, HbA1c）、C-反应蛋白（C-reactive protein, CRP）、白细胞计数（White blood cell count, WBC）、血浆凝血酶原时间（Prothrombin time, PT）、活化部分凝血活酶时间（ Activated partial thromboplastin time, APTT ）、纤维蛋白原含量（Fibrinogen, FIB）、乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase, LDH）、肌酐均显著上升（P＜0.05）。<br>　　2. 应用qRT-PCR实验测定创缘皮肤组织中WTAP mRNA的相对表达量。结果显示，与DFU前组相比，DFU后组WTAP mRNA的表达量显著升高（P＜0.001）；与SUC前组相比，SUC后组WTAP mRNA的表达量显著升高（P=0.005）；与SUC前组相比，DFU前组WTAP mRNA的相对表达量显著下降（P＜0.001）。<br>　　3. 应用Western Blot实验测定创缘皮肤组织中WTAP蛋白相对表达量，结果显示，与DFU前组相比，DFU后组WTAP蛋白相对表达量显著升高（P＜0.001）；与SUC前组相比，SUC后组WTAP蛋白相对表达量显著升高（P＜0.001）；与SUC前组相比，DFU前组WTAP蛋白相对表达量显著下降（P＜0.001）。<br>　　4. 应用免疫组化方法，测量创缘皮肤组织切片平均光密度值（Average density， AOD），对创缘皮肤组织中WTAP的表达水平进行半定量分析。结果显示，与DFU前组相比，DFU后组WTAP的AOD显著升高（P=0.003）；与SUC前组相比，SUC后组WTAP的AOD显著升高（P=0.017）。<br>　　5. 通过比色法测定创缘皮肤组织中总RNA中m6A甲基化RNA的比例（m6A%）。结果显示，与DFU前组相比，DFU后组m6A%显著升高（P＜0.001）；与SUC前组相比，SUC后组m6A%显著升高（P＜0.001）；与SUC前组相比，DFU前组m6A%显著下降（P=0.003）。<br>　　6. 应用qRT-PCR检测创缘皮肤组织中METTL3和METTL14 mRNA的表达量。结果显示，与DFU前组相比，DFU后组METTL3（P＜0.001）和METTL14（P＜0.001） mRNA表达量均显著升高；与SUC前组相比，SUC后组METTL3（P＜0.001）和METTL14（P＜0.001） mRNA表达量均显著升高；与SUC前组相比， DFU前组METTL3（P＜0.001）和METTL14（P＜0.001） mRNA表达量均显著下降。<br>　　7. 使用WB检测创缘皮肤组织中METTL3和METTL14蛋白表达量。结果显示，与DFU前组相比，DFU后组METTL3（P＜0.001）和METTL14（P＜0.001）蛋白表达量均显著升高；与SUC前组相比， SUC后组METTL3 （ P＜0.001 ）和METTL14 （P＜0.001）蛋白表达量均显著升高；与SUC前组相比，DFU前组METTL3（P＜0.001）和METTL14（P＜0.001）蛋白表达量均显著下降。<br>　　8. Pearson相关分析显示，在DFU组中，m6A%与WTAP表达量呈正相关（r=0.484，P=0.008）；在SUC组中，m6A%与WTAP表达量呈正相关（r=0.877， P＜0.001）。在DFU组中，Δm6A%与ΔWTAP呈正相关（r=0.592，P=0.001）；在SUC组中，Δm6A%与ΔWTAP呈正相关（r=0.674，P=0.023）。在DFU组中，WTAP高表达变化组4周伤口愈合率显著高于低表达变化组（χ2=4.243，P＝0.039）。<br>　　9. 体外细胞实验。qRT-PCR结果显示，与NG+siNC组（正常糖对照组）相比， HG+siNC组（高糖对照组）WTAP mRNA表达显著降低（P＜0.001）。CCK8实验结果显示，与NG+siNC组相比，NG+siWTAP组（正常糖WTAP敲低组）HaCaT细胞存活率显著降低（P＜0.001）；与HG+siNC组相比，HG+siWTAP组（高糖WTAP敲低组）HaCaT细胞存活率显著降低（P＜0.001）。划痕实验结果显示， 24h后NG+siWTAP组伤口愈合率显著低于NG+siNC组（P=0.001），HG+siWTAP组伤口愈合率显著低于HG+siNC组（P=0.001）。<br>　　结论<br>　　WTAP介导m6A RNA甲基化可有助于负压伤口治疗促进糖尿病足溃疡愈合，其机制可能与WTAP促进角质形成细胞的迁移和增殖功能有关。