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摘要[目的]<br>　　蛹虫草（Cordyceps militaris）寄生于鳞翅目幼虫的茧和蛹上的麦角菌科、虫草属真菌，在吉林省主要生长在长白山地区，因长白山独特的地理位置和气候特点使其具有特殊的品质，具有较高的研究价值。蛹虫草中含有多种活性成分，目前对蛹虫草多糖（Cordyceps militaris polysaccharide, CMP）尚未进行系统的研究，关于蛹虫草多糖对学习记忆的研究报道较少。学习和记忆能力下降是一种普遍现象，学习记忆能力下降备受关注，已经严重影响到人们的正常生活。近年来，临床研究发现CMP对学习记忆具有一定的改善作用，但具体的作用机制尚不清楚。<br>　　本研究选取长白山道地药材蛹虫草为原料，采用单因素实验、响应面分析法优化CMP的提取工艺，分别用二乙胺基乙基纤维素-52（Diethyl-Aminoethanol-52, DEAE-52）和二乙胺基乙基纤维素（Diethyl-aminoethanol, DEAE）分离纯化CMP，提高多糖的纯度，并测定CMP的单糖组成和结构以及体外抗氧化活性。经上述实验提取优化得到的CMP给予大鼠灌胃3周，同时采用行为学、酶联免疫吸附法（Enzyme linking mmunosorbent assay, ELISA）等多种方法，研究CMP对大鼠学习记忆能力的影响并初步探讨其影响机制。研究成果有望为临床改善学习记忆等相关疾病提供重要的理论基础。<br>　　[方法]<br>　　利用单因素实验、响应面分析法优化CMP的提取工艺；利用二苯基苦基苯肼（2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl, DPPH）自由基、2，2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulpho nic acid), ABTS+）自由基清除法和铁氰化钾比色法来评价CMP的体外抗氧化活性；利用DEAE纤维素柱层析法纯化优化后的CMP；利用DEAE-52纤维素柱层析法分离纯化后的CMP；利用高效液相色谱分析（High performance liquid chromatography, HPLC）测定0.1mol/L盐洗蛹虫草多糖组分（CMP-1）和水洗蛹虫草多糖组分（CMP-2）的单糖组成；利用刚果红实验鉴定CMP-1和CMP-2的三螺旋结构；利用Morris水迷宫实验（Morris water maze, MWM）观察CMP对大鼠学习记忆能力的影响；利用旷场实验测试各组大鼠的学习记忆能力；利用ELISA法检测CMP对大鼠血清中超氧化物歧化酶（ Superoxide dismutase, SOD ）和谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathione peroxidase, GSH-Px）活性的影响；利用ELISA法检测CMP对大鼠海马组织内去甲肾上腺素（Noradrenaline, NE）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine, 5-HT）和多巴胺（Dopamine, DA）的含量的影响。<br>　　[结果]<br>　　（1）单因素实验结果表明，提取时间在0~180 min内，CMP提取率随水浴提取时间的延长呈先上升后下降的趋势，在水浴时间为120 min时，CMP提取率达到峰值，为（9.24±0.02）%。在料液比为1:20~1:60（g/mL）内，CMP提取率先上升后下降，当料液比为1:30（g/mL）时，提取率达到最大，为（9.35±0.04）%。在水浴温度50~80ºC时，CMP提取率呈先上升后下降的趋势，提取温度为60ºC时，CMP提取率达到峰值，为（10.41±0.02）%。<br>　　（2）响应面实验结果表明，热水提取法提取CMP的最佳提取条件为料液比1:29.2 g/mL，提取时间115 min，提取温度为60.4ºC，多糖提取率可达10.736%。<br>　　（3）体外抗氧化活性分析表明，多糖浓度在200~2600 ug/mL范围内，CMP对DPPH自由基的清除率为17.8%~80.74%，CMP对ABTS+自由基的清除率为24.06%~80.77%。CMP的浓度为200~2600 ug/mL时，对2种自由基都有明显的清除活性并且具有还原铁离子的能力。<br>　　（4）棉状DEAE纤维素层析纯化CMP结果表明，多糖纯度从55%提高到77.08%。<br>　　（5）DEAE-52纤维素柱层析分离CMP结果表明，用去离子水和0.1 mol/L NaCl分离出两个主要组分CMP-2和CMP-1。<br>　　（6）高效液相色谱分析表明，CMP-1是由半乳糖醛酸（Gal A）、葡萄糖（Glu）组成，CMP-2是由甘露糖（Man）、核糖（Rib）、鼠李糖（Rha）、葡萄糖醛酸（Glu A）、半乳糖醛酸（Gal A）、葡萄糖（Glu）、木糖（Xyl）和阿拉伯糖（Arab）组成，单糖组分极其丰富。<br>　　（7）刚果红实验结果表明，在NaOH浓度为0 mol~0.1 mol时，CMP-1的max由493 nm移动到497 nm，CMP-2的max由491 nm移动到500 nm，均发生了红移。当NaOH 浓度超过0.1 mol后，CMP-1和CMP-2最大吸收波长开始下降。在高浓度碱性环境下，CMP-1和CMP-2的三螺旋结构被破坏。因此，CMP-1和CMP-2都具有三螺旋结构。<br>　　（8）MWM实验结果显示，CMP中、高剂量组大鼠的逃避潜伏期（Escape latency, EL）与对照组相比显著缩短（均为p＜0.05）；与CMP低剂量组相比， CMP高剂量组EL显著缩短（p＜0.05）。CMP中、高剂量组大鼠穿越原平台的次数与对照组相比显著增加（均为p＜0.05）。<br>　　（9）旷场实验的结果显示，对大鼠给予CMP灌胃3周后，与对照组大鼠相比，CMP中、高剂量组大鼠在旷场箱体中央区域运动距离显著延长（p＜0.01），在旷场箱体内最大运动速度（p＜0.01）明显提高。表明中、高剂量的CMP显著提高大鼠的自主运动能力。<br>　　（10）ELSIA实验结果显示，CMP中剂量组大鼠血清中SOD活性与对照组相比显著增加（均为p＜0.05），CMP高剂量组大鼠血清中SOD活性与对照组相比显著增加（均为p＜0.01），CMP高剂量组与低剂量组相比，SOD的活性显著增加（p＜0.01）；CMP高剂量组大鼠血清中GSH-Px的活性与对照组和低剂量组相比显著增加（p＜0.01）。<br>　　（11）ELISA实验结果显示，CMP中剂量组、CMP高剂量组5-HT水平均较对照组显著升高（p＜0. 01）；CMP中剂量组NE水平较对照组显著升高（p＜0. 05），CMP高剂量组NE水平较对照组显著升高（p＜0. 01）；CMP中剂量组、CMP高剂量组DA水平均较对照组显著升高（p＜0. 01）。<br>　　[结论]<br>　　1. 确定了最佳提取工艺为：料液比1:29.2 g/mL，提取时间115 min，提取温度为60.4ºC，多糖提取率可达10.736%。进一步分离纯化CMP-1由2种单糖组成、CMP-2由8种单糖组成，鉴定其均具有三螺旋结构。<br>　　2. 提取后的CMP在体外具有很好的抗氧化活性。<br>　　3. CMP能够提高大鼠的学习记忆能力，可能是通过提高SOD和GSH-Px活性降低了氧化应激水平，进一步增加了大鼠海马组织内的NE、DA和5-HT的含量。