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摘要[实验目的]<br>　　本研究探究海马齿状回（dentate gyrus, DG）的促肾上腺皮质激素释放因子（corticotropin-releasing factor, CRF）及其 1型受体（corticotropin-releasing factor receptor 1, CRFR1）在慢性应激（chronic stress, CS）影响衰老大鼠海马学习和记忆中的作用及可能机制。<br>　　[实验方法]<br>　　SD雄性大鼠随机分为对照（control, Con）、衰老（Aging）和衰老给予应激刺激（Aging+CS）组。采用持续腹腔注射 D-半乳糖（D-galactose, D-gal） 7周的方法制备 Aging大鼠模型，并在模型制备后的 4周内，每天随机给予 1种不同应激原刺激，形成大鼠的 CS状态，并记录 CS期间大鼠的体重和摄食量改变。利用酶联免疫吸附法检测大鼠血浆中皮质酮（corticosterone, CORT）的含量；利用 Morris 水迷宫、新物体识别、Y迷宫实验检测大鼠海马的学习和记忆能力；利用免疫组织化学染色的方法检测大鼠海马 DG 区 CRF 和 CRFR1 的表达；应用蛋白免疫印迹（ western blot, WB）技术检测双皮质素（ doublecortin, DCX）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶 II（calcium/calmodulin-dependent protein kinase II, CaMKII）、环磷腺苷反应元件结合蛋白（cAMP response element-binding protein, CREB）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）、α-氨基-3-羟基-5-甲基-4-异唑受体（α-amino-3-hydroxy-5-methy l-4-isox-azolepropionic acid receptor, AMPAR）及 N-甲基-D-天冬氨酸受体（ N-methyl-D-aspartic acid receptor, NMDAR ）的 2B 亚基（ NMDA receptor 2B, NR2B）的表达；利用免疫荧光染色技术检测海马 DG 区囊泡谷氨酸转运体 1（vesicular glutamate transporter 1, VGLUT1）和 DCX的表达。<br>　　[实验结果]<br>　　（1）与 Con组比较，Aging和 Aging+CS组大鼠的体重均显著下降（Plt;0.05），而 Aging+CS 组大鼠体重下降更为明显，自 CS第 24 天起差异显著（Plt;0.05），但三组大鼠的总摄食量无显著差异(Pgt;0.05)。糖皮质激素是公认的应激激素，本研究检测大鼠血浆中的 CORT 水平发现Con 组与 Aging 组之间无显著差异(Pgt;0.05) ，而与 Aging 组比较， Aging+CS组大鼠血浆中的 CORT水平明显升高（Plt;0.05），上述结果提示， Aging+CS组大鼠处于 CS状态。<br>　　（ 2）行为学实验结果显示，与 Con组相比，Aging组大鼠在 Morris水迷宫实验中的逃避潜伏期明显延长、目标象限游泳时间百分比和穿越原平台区次数显著减少，且新物体识别实验的识别指数和 Y迷宫实验的新异臂探索时间也显著降低（均为 Plt;0.05）；然而，Aging+CS 组大鼠与 Aging 组相比，逃避潜伏期显著缩短，目标象限游泳时间百分比、穿越原平台区次数、识别指数和新异臂探索时间均显著增加（均为Plt;0.05）。<br>　　（ 3）免疫组织化学染色结果显示，Aging组大鼠海马 DG区 CRF及CRFR1的表达明显低于 Con组（Plt;0.05），而 Aging+CS组大鼠 DG区CRF和 CRFR1的表达均显著升高（与 Aging组比较，Plt;0.05）。<br>　　（ 4）衰老引起的海马新生神经元减少是学习记忆损伤的重要机制之一，本研究通过观察 DG区 DCX的表达水平评估了神经元的再生。结果显示，与 Con组相比，Aging组大鼠海马 DG区 DCX表达明显减少，而在 CS条件下，Aging大鼠 DG区 DCX表达却显著增加（均为 Plt;0.05）。<br>　　（ 5）为了观察 DG的 CRFR1在 CS影响 Aging大鼠海马学习记忆中的作用，应用脑部微量注射法，在行为学测试前向大鼠 DG注射 2μL 的CRFR1 阻断剂 R121919 （ 1 μg/μL, Aging+CS+R121919 组）或等剂量的生理盐水（Normal saline, NS），包括 Aging+NS 和 Aging+CS+NS 组。行为学实验结果显示，与 Aging+CS+NS组大鼠比较，Aging+CS+R121919组大鼠的逃避潜伏期明显延长（Plt;0.05）、目标象限游泳时间百分比和穿越原平台区次数明显下降（Plt;0.05）、新物体识别指数和新异臂探索时间均显著降低（均为 Plt;0.05）。<br>　　（ 6）为了探讨 DG的 CRFR1调节 CS下 Aging大鼠海马学习记忆功能的可能机制，本研究应用 WB 法检测参与海马学习记忆的关键通路CaMKII-CREB-BDNF 的变化。结果发现，与 Aging+NS 组相比， Aging+CS+NS组大鼠 p-CaMKII/CaMKII和 p-CREB/CREB比值和 BDNF表达均上升（均为 Plt;0.05 ） ，而阻断 CRFR1 后 p-CaMKII/CaMKII 和p-CREB/CREB比值及 BDNF表达均显著下降（均为 Plt;0.05）。<br>　　（ 7）海马学习和记忆依赖谷氨酸能信号的传递，因此本研究还观察了谷氨酸转运体 VGLUT1、谷氨酸离子型受体 AMPAR和 NR2B的表达。结果发现，与 Aging+NS组比较，Aging+CS+NS组大鼠 DG区 VGLUT1和 AMPAR 表 达 均 增 加 （ Plt;0.05 ） ， 而 阻 断 DG 区 CRFR1 （ Aging+CS+R121919组）可逆转上述变化；DG区 NR2B的表达在三组间无显著差异(Pgt;0.05)。<br>　　（ 8）为了观察 CRFR1对海马神经发生的影响，本研究利用免疫荧光染色技术检测了海马 DG区 DCX表达。结果发现，与 Aging+NS组相比 ， Aging+CS+NS 组 大 鼠 海 马 DG 区 DCX 表 达 增 多 ， 而Aging+CS+R121919组大鼠海马 DG区 DCX表达显著减少。<br>　　[结论]<br>　　（ 1） CS通过增强海马DG区CRF-CRFR1系统活动改善Aging大鼠学习记忆功能损伤，其机制与增加神经再生与谷氨酸能信号传递，包括突触前囊泡转运和突触后 AMPAR表达有关。<br>　　（ 2）海马DG区CRFR1通过影响CaMKII-CREB-BDNF信号通路活性，参与 CS条件下的 Aging大鼠学习记忆功能调节。