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摘要[目的]<br>　　骨缺损的修复是当前临床研究关注的热点。近年来，间充质干细胞在骨再生领域受到广泛关注，人源脐带间充质干细胞（hUCMSCs）是从脐带中获得的，具有分化潜力高、增殖能力强、体外扩增效率高、避免免疫排斥、不存在伦理问题等特点。体外和体内实验中hUCMSCs均表现出较强的成骨分化能力。组蛋白去甲基化酶能够去除组蛋白上的甲基化修饰，在细胞分化、发育、疾病发生和成骨分化中都起着重要的作用。KDM3A是组蛋白去甲基化酶家族中的一员，有研究报道， KDM3A在维持软骨细胞和抑制骨关节炎中有作用，然而， KDM3A是否参与hUCMSCs的成骨诱导过程及其具体机制，尚不清楚。因此，本课题通过构建过表达/敲低KDM3A的质粒研究KDM3A调控hUCMSCs成骨分化并促进小鼠骨缺损愈合的机制。<br>　　[材料与方法]<br>　　1、取新鲜脐带剥离华通氏胶组织，剪碎成组织块，加入完全培养基培养14天，消化收集细胞，此为第0代细胞P0，继续传代培养至第三代进行流式细胞术实验和成骨诱导实验，以检测其是否为间充质干细胞。<br>　　2、取第三代hUCMSCs进行成骨诱导，提取不同成骨诱导天数hUCMSCs的RNA，用qRT-PCR检测KDM3A的表达变化。<br>　　3、设计并构建KDM3A过表达、敲低及其对照的空载质粒，将实验分为五组，分别是过表达KDM3A（OE-KDM3A），敲低KDM3A（Sh-KDM3A），空白对照（Control），过表达对照质粒（OE-NC）及敲低对照质粒（Sh-NC）。将质粒转染进间充质干细胞并分别在24 h和48 h后提取RNA和蛋白质用qRT-PCR和Western Blot检测KDM3A的表达。<br>　　4、hUCMSCs转染质粒24 h后加入成骨诱导液，提取第1、3、5、7、10、14天的蛋白用Western Blot检测成骨标志物Runx2和骨桥蛋白（OPN）的表达。并分别在7天和21天时进行碱性磷酸酶染色和茜素红染色。<br>　　5、建立小鼠颅骨损伤的模型，以水凝胶为细胞支架，将hUCMSCs植入小鼠颅骨缺损部位。分4组准备，分别为KDM3A正常表达对照组（Control），KDM3A过表达组（OE-KDM3A），KDM3A敲低组（Sh-KDM3A），不植入hUCMSCs的空白对照组（空白组），每组10只。造模后8周用成像系统对小鼠颅骨进行X线检查，之后处死动物，取缺损部位的颅骨，制作骨组织的石蜡切片并进行苏木素-伊红（HE）染色。<br>　　[结果]<br>　　1、在hUCMSCs成骨诱导第3-10天KDM3A的表达随着成骨诱导天数的增加而增加，而到第14天时表达下降；<br>　　2、在成骨诱导1、3、5天时OE-KDM3A组相比OE-NC组和Control组Runx2表达明显增加，而Sh-KDM3A组Runx2表达明显减少；<br>　　3、在成骨诱导第7、10、14天时OE-KDM3A组相比OE-NC组和Control组OPN表达明显增多，而Sh-KDM3A组OPN表达明显减少；<br>　　4、成骨诱导第7天的碱性磷酸酶染色结果显示OE-KDM3A组相比Control组染色较深，而Sh-KDM3A组染色较浅。成骨诱导第21天的茜素红染色结果显示OE-KDM3A组相比Control组红色较深，钙结节产生较多，而Sh-KDM3A组红色较浅；<br>　　5、X射线检测小鼠颅骨缺损愈合情况，结果显示OE-KDM3A组的骨痂厚度相比Control增加，Sh-KDM3A组相对较薄，而不植入干细胞造模后不做处理的空白组骨骼愈合情况最差；<br>　　6、HE染色结果显示OE-KDM3A组的伤口骨生长情况最佳，骨紧密排列致密，而Sh-KDM3A组相比Control组生长情况较差，骨基质排列疏松，而未经处理的空白组生长情况最差。<br>　　[结论]<br>　　组蛋白去甲基化酶KDM3A通过上调Runx2的表达，促进间充质干细胞向成骨细胞分化，增加了OPN的表达，影响骨的发生，促进了hUCMSCs的成骨分化过程，从而促进骨缺损的修复。