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摘要研究背景：肺腺癌（Lung adenocarcinoma，LUAD）是一种高致死性的呼吸系统癌症，是最常见的肺癌类型。具有总体预后差，生存率低等特点。当前，早期LUAD的治疗以手术切除为主；晚期以全身治疗为核心，包括化疗、靶向治疗等。随着医学的不断发展，靶向治疗凭借其高精准性、高效性以及分子靶点特异性等优势，日益成为现代癌症治疗体系中的关键支柱。但临床应用仍面临多重挑战，比如其应用受限于适用人群筛选、易因肿瘤异质性或基因突变产生耐药性，部分药物还可能引发独特副作用。因此，亟待深入研究LUAD发生与发展的分子机制，为LUAD的诊治提供更多有效的分子靶点和生物标志物。<br>　　细胞周期是指细胞从一次分裂完成开始到下一次分裂结束所经历的全过程，分为间期与分裂期两个阶段。细胞周期的失调是癌症最显著的特征之一，癌细胞通过逃避细胞周期的正常调控机制，能够持续地进行细胞分裂，从而形成肿瘤，并不断生长。研究显示靶向诱导细胞周期阻滞，可抑制肿瘤细胞生长，阻碍癌症的进展。因此，探明细胞周期调控机制，有望为肿瘤靶向治疗提供潜在治疗靶点。<br>　　CD3e分子表皮细胞相关蛋白（CD3e molecule associated protein，CD3EAP）是RNA聚合酶I复合物的一个组成部分，参与核糖体生物合成促进细胞增殖。已有研究表明，CD3EAP的异常表达与结肠癌、肝癌等多种癌症的发生发展密切相关。在课题组前期研究中，通过检索数据库发现CD3EAP可能与LUAD细胞的细胞周期进程密切相关，但尚未有相关研究报道CD3EAP在LUAD中调控细胞周期的作用。因此本研究旨在探究CD3EAP在LUAD细胞增殖、迁移、EMT进程和细胞周期等多种生物学功能中的作用，并阐明CD3EAP调控细胞周期的具体分子机制。<br>　　研究目的：1.探究CD3EAP在LUAD细胞增殖、迁移、EMT进程和细胞周期中的作用；2.探究CD3EAP在LUAD细胞中调控细胞周期的分子机制；3.探究 CD3EAP在LUAD中的预后标志物作用。<br>　　实验方法：1. 通过TIMER 2.0和TCGA数据库分析CD3EAP在泛癌和LUAD组织中的表达水平；应用Kaplan-Meier分析CD3EAP表达与LUAD患者生存期之间的关系；运用LUAD患者癌组织芯片分析CD3EAP与LUAD患者临床病理参数的相关性；2. 在A549和H2228细胞中转染CD3EAP过表达和敲减的慢病毒构建稳定转染细胞系，检测LUAD细胞中CD3EAP基因对细胞增殖、集落形成以及迁移能力的影响；3. 蛋白印迹实验检测过表达和敲减CD3EAP对LUAD细胞EMT相关蛋白的影响；4. 公共数据库进行GSEA富集分析CD3EAP主要富集的通路和蛋白；流式细胞术检测过表达和敲减CD3EAP后对A549和H2228细胞周期的影响；蛋白印迹实验检测CD3EAP对细胞周期相关蛋白CDK2和Cyclin E1表达水平的影响；5. RT-qPCR检测CD3EAP对CDK2 mRNA水平的影响；加入CHX、 MG132后检测CDK2的蛋白稳定性是否受CD3EAP调节；泛素化实验验证CD3EAP对CDK2 泛素化水平影响，同时Co-IP和免疫荧光实验检测CD3EAP与CDK2的相互作用；6. 动物实验检测CD3EAP对LUAD细胞体内增殖的影响；运用免疫组织化学染色验证CD3EAP差异表达对小鼠肿瘤组织中Ki-67、CDK2的影响。<br>　　结果：1. CD3EAP在LUAD中呈高表达并与不良预后相关：（1）TIMER 2.0和TCGA数据库结果显示，CD3EAP在LUAD中高表达（plt;0.05），并且高表达CD3EAP的患者生存期较短（plt;0.05）；（2）对临床LUAD患者癌组织芯片进行免疫组织化学染色，并对临床病理参数进行统计分析，结果显示，CD3EAP在肿瘤组织中高表达，并与患者年龄、肿瘤大小、临床分期、TNM分期、病理分级具有显著相关性（plt;0.01）。2. CD3EAP促进LUAD细胞的集落形成和增殖能力：（1）集落形成和CCK8实验结果显示，过表达CD3EAP后显著促进LUAD细胞的集落形成和增殖能力（ plt;0.05 ） ，敲减CD3EAP结果与之相反（plt;0.05）。3. CD3EAP促进LUAD细胞迁移、EMT进程：（1）划痕实验结果显示，过表达CD3EAP后显著促进了LUAD细胞的横向迁移能力（plt;0.05），敲减CD3EAP后结果与之相反（plt;0.05）；（2）Transwell实验结果显示，过表 达CD3EAP后显著促进了LUAD细胞的纵向迁移能力（plt;0.01），敲减CD3EAP后结果与之相反（plt;0.01）；（3）蛋白印迹实验结果显示，过表达CD3EAP后，间质标志物Vimentin表达显著上调（plt;0.05），而上皮标志物E-cadherin表达下调（plt;0.05），敲减组与之相反（plt;0.05）。4. CD3EAP上调CDK2的表达促进LUAD细胞的细胞周期进程：（1）应用LinkedOmics数据库进行GSEA富集分析，结果显示，CD3EAP在LUAD中主要富集在细胞周期相关通路，并与细胞周期蛋白CDK2、Cyclin E1相关；（2）流式细胞术和蛋白印迹实验结果显示， CD3EAP促进LUAD细胞的细胞周期从G1向S期转化（plt;0.05）。5. CD3EAP通过泛素-蛋白酶体途径抑制CDK2的降解：（ 1 ） RT-qPCR实验结果显示， CD3EAP对CDK2 mRNA水平没有显著影响；（2）CHX处理细胞结果显示，敲减CD3EAP的LUAD细胞CDK2蛋白降解的速度加快（plt;0.05）；（3）MG132处理细胞结果显示，显著逆转了LUAD细胞中敲减CD3EAP引起的CDK2蛋白表达下降（plt;0.05），这说明CD3EAP能够维持LUAD细胞中CDK2蛋白的稳定性；（4）泛素化实验结果显示，敲减CD3EAP增加CDK2 的泛素化水平；（ 5 ） Co-IP 实验及免疫荧光实验验证 CD3EAP与CDK2存在相互作用。6. CD3EAP促进体内LUAD的肿瘤生长和细胞周期：（1）裸鼠皮下荷瘤模型显示：CD3EAP过表达组小鼠肿瘤重量和体积明显增加（plt;0.05）,CD3EAP敲减组小鼠肿瘤重量和体积明显低于对照组（plt;0.01）；（2）小鼠肿瘤组织免疫组织化学染色结果显示：CD3EAP过表达组Ki-67、CDK2表达显著上调，敲减CD3EAP组与之相反。<br>　　结论：1. CD3EAP在LUAD中高表达，并与不良预后相关；2. CD3EAP可促进LUAD细胞增殖、迁移和EMT进程，并诱导细胞周期转化；3. CD3EAP通过泛素-蛋白酶体途径抑制CDK2的降解，促进LUAD细胞的细胞周期进程。