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摘要本研究分为四部分：<br>　　 第一部分：体外人ESCs 蜕膜化模型的建立和鉴定<br>　　 目的：建立体外培养人子宫内膜基质细胞蜕膜化的模型，并鉴定蜕膜化模型的有效性。<br>　　 方法：人子宫内膜组织原代培养，采用8-Br-cAMP和MPA 蜕膜化方法处理第四代ESC细胞，免疫组织化学技术检测原代培养细胞中波形蛋白和角蛋白的表达，显微镜下观察蜕膜化过程中细胞形态变化，化学发光法检测蜕膜化不同时间点细胞培养液中PRL 水平。<br>　　 结果：1. 原代培养细胞中波形蛋白在胞浆中表达强阳性，角蛋白无表达；2. 蜕膜化第一天（D1）到第四天（D4）ESCs形态从长梭形逐渐变为圆形，细胞体积变大，胞核增大，细胞边界变模糊；3. 化学发光法检测D1天到D4 蜕膜化组培养液中PRL水平逐渐升高，D4天达到蜕膜化水平，对照组PRL 水平无显著改变。<br>　　 结论：采用8-Br-cAMP和MPA 蜕膜化方法处理ESCs 在D4天达到成功蜕膜化水平，是研究体外蜕膜化过程的理想模型。<br>　　 第二部分：体外人ESCs 蜕膜化细胞周期及细胞周期芯片分析<br>　　 目的：研究在人ESCs 体外蜕膜化过程中细胞周期分布的差异，以及芯片分析在蜕膜化过程中细胞周期相关基因的差异性表达。<br>　　 方法：采用8-Br-cAMP和MPA 蜕膜化方法，分别选取体外蜕膜化0 小时（D0）、24 小时(D1)、48 小时(D2)和96 小时(D4)，采用流式细胞分析仪分析细胞周期分布的改变；选取D0～D4的蜕膜化ESCs和对照进行细胞周期芯片分析，筛选蜕膜化过程中差异表达的细胞周期相关基因。<br>　　 结果：体外蜕膜化过程中ESCs发生G0/1 到S 期阻滞。体外蜕膜化ESCs 蜕膜化0 小时、24 小时、48 小时和96 小时S 期比例分别为18.2%、8.51%、3.34%和0.38%，G0/G1 比例分别为65.7%、77.98%、84.88%和88.63%，G2/M 比例分别为15.47%、13.51%、11.21%和10.99%。细胞周期芯片结果显示在D2与D0 比较，差异倍数>2.0上调的基因有5个，差异倍数<0.50 下调的基因有8个；在D4与D0 比较，差异倍数>2.0 上调的基因有4个，差异倍数<0.50 下调的基因有7个。<br>　　 结论：TIMP3、CDKN1C、CUL4B、CDKN2B、CDK2、CCND1、CKS2、CDC6、CCNA2、CCNB1、CDC20和CDC2可能在ESC 脱离细胞周期走向分化过程中起着重要作用，但需进一步验证。<br>　　 第三部分：人ESCs 体外蜕膜化和非蜕膜化的micro-RNA 芯片分析和蜕膜化相关靶基因的预测<br>　　 目的：研究在人ESCs 体外蜕膜化与非蜕膜化中micro-RNA的差异性表达，并且对在蜕膜化过程中microRNA 调节相关靶基因的预测。<br>　　 方法：采用8-Br-cAMP和MPA 蜕膜化方法，选取体外蜕膜化D4和非蜕膜化C4组ESCs，进行microRNA 芯片的检测，利用real-time PCR对芯片结果进行验证；采用生物信息学预测microRNA 调节蜕膜化相关的靶基因，并进行功能分类。<br>　　 结果：芯片结果显示，蜕膜化与非蜕膜化ESCs 比较分析，49个microRNA 具有显著性差异，16个microRNA 显著性上调，33个microRNA 显著性下调；选取has-miR-27b，30c，143，101，181b，29b，30d，507，107，216，139，23a，222，221 进行real-time PCR 进行验证，其中has-miR-27b，30c，143，101，181b，29b，30d，507，23a，222，221 具有显著性差异（P<0.05）；生物信息学分析预测microRNA调节蜕膜化相关的靶基因，根据靶基因的功能分为六类：1，转录因子和DNA 粘附蛋白；2，细胞外基质和相关分子；3，细胞内信号分子；4，细胞周期调节；5，生长因子，细胞因子受体和粘附蛋白；6，酶代谢相关分子。<br>　　 结论：在人子宫内膜蜕膜化过程中microRNA 差异性表达，可能在蜕膜化过程中发挥了重要作用。<br>　　 第四部分：Has-miR-222 在人ESC 蜕膜化过程中通过p57 调节ESC细胞周期<br>　　 目的：本文通过转染has-miR-222 inhibitors 下调has-miR-222，研究has-miR-222对人体外蜕膜化ESCs的细胞周期和p57的调节；并构建和共转染p57荧光素酶报告基因载体，研究has-miR-222对细胞周期素依赖性蛋白激酶抑制蛋白（CKI）p57的表达调控。<br>　　 方法：构建合成2'-O-Me-222-inhibitors 寡核苷酸、阴性对照和FITC 连接的阴性对照，转染至体外培养的ESCs中，转染后6 小时在荧光显微镜下观察荧光素的表达，判定转染效率，然后再进行体外蜕膜化48 小时后采用流式细胞分析仪分析细胞周期，采用免疫印迹方法检测CDKN1C/p57kip2 蛋白表达，比较转染和对照组细胞周期及CDKN1C/p57kip2 蛋白的表达变化；构建pMIR-p57 载体和对照，与has-miR-222inhibitors和对照共转染ESCs24 小时后检测双荧光素酶活性，分析p57 报告基因的表达。<br>　　 结果：ESCs转染has-miR-222 inhibitors后与对照组相比S 期比例从10.93%下降至6.25%，G0/G1 期比例从73.05%升高至77.52%；体外蜕膜化48 小时ESCs转染has-miR-222 inhibitors后，S 期比例从7.83%下降至3.34%，G0/G1 期比例从74.94%升高至80.74%。转染has-miR-222 inhibitors后，Western blot检测ESCs中p57 蛋白表达显著性升高（P<0.05）；pMIR-p57 载体和has-miR-222 inhibitors 共转染ESCs后，与对照组相比荧光素酶的活性显著升高（P<0.05）。<br>　　 结论：在体外蜕膜化过程中，随着蜕膜化时间的增加ESCs的S 期逐渐下降，G0/G1期逐渐升高，下调has-miR-222 更显著降低S 期的细胞数量和提高p57表达，从而抑制ESCs的生长，因此Has-miR-222 在人ESC 蜕膜化过程中可能是通过p57 调节ESC细胞周期的变化。