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摘要研究目的和内容：通过比较FMR1 KO鼠和WT鼠海马GAD、GABAAR α5表达的改变，了解GABA能神经元数量和结构变化是否为FMR1 KO鼠癫痫易感的基础。通过比较FMR1 KO鼠和WT鼠海马组织以及GABA 能神经元NaV1.1蛋白表达的改变，探讨NaV1.1对FMR1 KO鼠神经元钠电流可能的影响。通过检测FMR1 KO鼠和WT鼠海马中间神经元和锥体神经元钠电流的电生理学变化，从而进一步在功能上探讨抑制性神经元兴奋性改变在FMR1 KO鼠癫痫形成中的作用。<br>　　 研究方法：<br>　　 1.FMR1基因敲除鼠模型的鉴定<br>　　 FVB品系小鼠饲养在19～21 ℃自然光条件下，自由获取食物和水分。选取14-17 天龄的FMR1 KO鼠和WT 鼠，一般选取雄性小鼠，实验前取尾提取DNA，PCR技术进行基因型鉴定。<br>　　 2.荧光实时定量逆转录PCR检测<br>　　 目标基因的表达量在解剖显微镜下分离海马组织。在玻璃匀浆器中加入海马脑组织和RNAisoReagent Trizol 研磨，提取总RNA。逆转录cDNA 后进行荧光实时定量逆转录PCR检测GAD、GABAAR α5、NaV1.1和内参GAPDH的mRNA，并进行相对定量分析。<br>　　 3．Western blotting检测<br>　　 目标蛋白表达水平同上方法分离海马组织，提取蛋白后检测蛋白浓度，进行Western blotting。电泳转膜后分别使用GAD、GABAAR α5、NaV1.1和内参β-actin的抗体孵育，然后孵育相应二抗，曝光显影后对条带进行定量分析。<br>　　 4.免疫组化和免疫荧光双标检测<br>　　 目标蛋白共表达水平多聚甲醛灌注小鼠，冰冻切片，做GAD细胞免疫组化，统计细胞数目，并孵育GAD和NaV1.1的抗体以及相应二抗，在荧光显微镜下观察，GAD 神经元和NaV1.1 共表达分析。<br>　　 5．膜片钳检测<br>　　 钠电流特征急性分离海马神经元，分别选取中间神经元和锥体神经元，在全细胞电压钳模式下给予标准刺激方案，根据所得电流数据建立快速钠电流的激活曲线、失活曲线和失活后复活曲线，计算持续钠电流的最大波幅，激活电压和电流密度等进行比较。<br>　　 6．统计学分析<br>　　 计量资料以均数±标准差(x±s)表示，统计方法用SPSSl6.0 for Windows软件包进行统计分析，采用t 检验。P＜0.05为差异具有统计学意义<br>　　 研究结果：<br>　　 1.FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABA能神经元数目和GAD表达的变化<br>　　 FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABA能神经元数目的比较：FMR1 KO鼠海马GABA 能神经元80±20.134，WT 鼠95.11±14.186，差异具有统计学意义（P=0.007）；CA1 区FMR1 KO鼠32.24±7.710，WT 鼠39.59±6.738，差异具有统计学意义（P=0.002）；CA3 区FMR1 KO鼠29.94±10.028，WT 鼠35.07±6.324 差异具有统计学意义（P=0.043）；DG 区FMR1 KO鼠17.82±5.703,WT 鼠20.44±3.545,差异不具有统计学意义（P=0.066）；在mRNA水平的比较：FMR1 KO鼠GAD67表达高于WT 鼠，差异具有统计学意义（P=0.006）。FMR1 KO鼠和WT 鼠海马GAD蛋白水平的比较：FMR1 KO鼠GAD67和GAD65的表达均高于WT 鼠，差异具有统计学意义（P=0.000）；在mRNA水平的比较：FMR1 KO鼠GAD67表达高于WT 鼠，差异具有统计学意义（P=0.006）。<br>　　 2.FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABAAR α5表达的变化<br>　　 FMR1 KO鼠和WT鼠海马GABAAR α5蛋白水平的比较：FMR1 KO鼠GABAAR α5的表达低于WT 鼠，差异具有统计学意义（P=0.000）；在mRNA水平的比较：FMR1KO鼠GABAAR α5表达低于WT 鼠，差异具有统计学意义（P=0.031）。<br>　　 3.FMR1 KO鼠和WT鼠海马NaV1.1表达的变化<br>　　 FMR1 KO鼠和WT 鼠海马NaV1.1 蛋白水平的比较：FMR1 KO鼠Nav1.1的表达高于WT 鼠，差异具有统计学意义（P=0.000）；在mRNA水平的比较：FMR1 KO鼠Nav1.1的表达高于WT 鼠，差异具有统计学意义（P=0.000）。<br>　　 4.FMR1 KO鼠和WT鼠海马神经元GAD和NaV1.1共表达<br>　　 Nav1.1通道蛋白在海马区的神经元均有表达：锥体层的锥体神经元和齿状回颗粒层的颗粒细胞胞体（未被GAD 标记）上的表达较弱，NaV1.1 蛋白在锥体层和颗粒层中散在分布的GAD 标记的神经元上却有着比较强的阳性表达。<br>　　 5.海马钠通道电生理特性<br>　　 5.1.钠通道的激活FMR1 KO鼠和WT 鼠锥体神经元V0.5与k 值分别为：FMR1 KO鼠（n=4）:-34.56±2.23(mV)，4.43±0.35；WT（n=4）:-37.87±2.18(mV)，4.69±0.41,差异无统计学意义(P＞0.05）；FMR1 KO鼠和WT 鼠中间神经元：FMR1 KO鼠（n=4）:-32.07±2.06(mV)，4.38±1.11；WT（n=4）:-32.56±1.68(mV)，5.02±0.4，差异无统计学意义(P＞0.05）。<br>　　 结论：<br>　　 1.本研究首次发现FMR1 KO鼠海马GABA 能神经元数目降低，其抑制性降低可能是导致FMR1 KO鼠癫痫易感性增高的原因之一，也为进一步研究提供了形态学的基础。<br>　　 2.本研究首次发现FMR1 KO鼠海马GABAAR α5蛋白表达减少，提示其介导的中间神经元抑制性降低可能是导致FMR1 KO鼠癫痫易感性增高的原因之一。<br>　　 3.本研究首次在FMR1基因敲除小鼠海马组织发现电压门控钠离子通道a 亚单位NaVl.1表达水平增高；进一步的电生理研究发现FMR1 KO鼠锥体神经元钠通道兴奋性的增强，中间神经元钠通道兴奋性降低。为FMR1 KO鼠癫痫易感性增高提供了电生理依据。不仅说明NaVl.1表达的增高可能所致是锥体神经元钠通道兴奋性增强的原因，而且为中间神经元抑制性降低导致FMR1 KO鼠癫痫易感性增高提供了电生理依据。在细胞水平中间神经元钠通道兴奋性降低的原因NaVl.1的表达情况及其与电生理的关系待进一步研究。<br>　　 4.本研究显示FMR1基因敲除小鼠海马组织GAD和NaVl.1mRNA和蛋白在转录和翻译水平表达均增高，支持FMRP 具有负性调控蛋白表达的作用。