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摘要目的：<br>　　为了探讨PR39对急性缺血心肌的保护作用，本研究构建腺相关病毒（AAV）介导的融和基因NT4-TAT-His-PR39，验证其在人脐静脉内皮细胞（ECV304细胞株）表达；在缺氧ECV304细胞内HIF-1α表达及抗缺氧应激凋亡作用及其对缺氧环境鸡胚促血管生成作用。<br>　　方法：<br>　　1．应用PCR技术和T载体克隆法克隆PR39基因，酶切鉴定，并进行DNA测序及分析。<br>　　2．将编码PR39、穿膜肽TAT、6×His标签肽及NT4信号肽的四个基因片段用DNA连接酶相连，构建pBV220/NT4-TAT-His-PR39融合基因载体，酶切获取NT4-TAT-His-PR39融合基因片段，将其装入质粒pSSHG/NT4-TAT-His-PR39。<br>　　3．采用磷酸钙沉淀法三质粒共转染293细胞，获得重组携带NT4-TAT-His-PR39的AAV载体，斑点杂交方法测定重组病毒滴度。<br>　　4．AAV-PR39和空病毒载体（EV）分别感染ECV304，免疫细胞化学检测6×His表达情况，以此验证融合基因的表达。<br>　　5．将ECV304分为AAV-PR39组和PBS组，在1％O2条件培养，免疫细胞化学测定ECV304中缺氧诱导因子1α（HIF-1α）表达。<br>　　6．流式细胞仪检测(FCM)分析低氧环境下ECV304细胞凋亡情况。<br>　　7．30只鸡胚随机分为AAV-PR39组、EV组和PBS组，将各组细胞分别在低氧（5％O2）和常氧（21％O2）条件培养，图象软件Image Pro Plus(IPP)分析鸡胚尿膜囊(CAM)血管密度。<br>　　结果：<br>　　1．PR39基因经DNA测序与Genebank序列一致。<br>　　2．NT4-TAT-His-PR39融合基因经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确，测序结果与实验设计的序列完全一致。<br>　　3．经酶切鉴定将融合基因成功插入至pSSHG载体中；斑点杂交测定病毒的滴度为3.4×109PFU/ml。<br>　　4．免疫细胞化学检测到实验组ECV304中6×His表达。<br>　　5．免疫细胞化学检测到缺氧ECV304细胞内HIF-1α蛋白表达高于PBS组（t=11.23,P<0.001）。<br>　　6．流式细胞仪分析低氧环境下ECV304细胞周期图，实验组ECV304中凋亡率明显小于PBS组。<br>　　7．低氧环境下，实验组的鸡胚尿膜囊血管密度明显大于PBS组及EV组。在常氧环境下，三组之间血管密度并无明显差别。<br>　　结论：<br>　　1．成功克隆PR39基因。<br>　　2．成功构建具有穿膜功能的“NT4-TAT-His-PR39”融合基因。<br>　　3．成功构建pSSHG/NT4-TAT-His-PR39重组腺相关病毒载体，并成功包装较高浓度的重组病毒。<br>　　4．重组携带NT4-TAT-His-PR39的AAV载体能在ECV304中进行分泌表达，并提高缺氧ECV304中HIF-1α蛋白的表达水平。<br>　　5．PR39具有抗缺氧应激细胞凋亡作用。<br>　　6．重组AAV-PR39载体对缺氧鸡胚血管生成具有显著的促进作用。