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摘要【引言】在肿瘤的发生、发展过程中，细胞增殖与凋亡失衡是其一个重要机制，凋亡受阻也是导致对肿瘤细胞的各种治疗疗效耐受的重要原因之一。凋亡过程涉及多条反应途径和多个调节因子，机制非常复杂，而凋亡蛋白抑制因子（inhibitorofapoptosisprotein，IAP）家族就是其中非常重要的一类抗凋亡因子，其结构的共同点是在它的N端含有一个或者是多个杆状病毒IAP重复序列（baculovirusIAPrepeat，BIR）串联在一起，而C端含或不含有一个环指（RINGfinger）结构。Survivin是IAP家族中的一个重要成员，多年来的研究表明，其在人类多种恶性肿瘤中均存在高表达，具有强大的抗细胞凋亡功能，与包括胃癌、卵巢癌等等在内的多种人类肿瘤的形成、发展及预后密切相关，其异常的表达水平升高极有可能是导致多种人类恶性肿瘤对化疗耐药和放疗抵抗的重要原因。<br>　　RNAi（RNAinterference）是由导入的双链RNA（doublestrandRNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象，最早由法尔和梅洛于1998年发现，广泛存在于地球上的高等植物和动物中。RNAi的机制是将dsRNA导入细胞内，dsRNA随后被Dicer酶(一种RNA酶)Ⅲ剪切，形成具有双链的小干扰RNA（smallinterferingRNA，siRNA），siRNA可与RNA诱导的基因沉默复合物相互结合，从而降解靶向mRNA（与siRNA的碱基序列呈互补关系），特异性的抑制靶基因表达。RNAi技术具有简便易行、特异高效的特点，被《Science》杂志评为2001年的十大科学进展之一，并名列2002年十大科学进展之首，已被广泛用于探索基因功能和恶性肿瘤的基因治疗领域<br>　　胃癌是我国常见的恶性肿瘤之一，在我国，发病率居各类常见良恶性肿瘤的首位。尽管我国对胃癌的预防和治疗已取得很大成果，但近年来随着社会生活水平的提高、工作节奏的增加等等原因，胃癌的发病率呈有增高趋势。在胃的恶性肿瘤中，腺癌占95％。因为胃癌易发生直接播散、血液转移和淋巴结转移，所以中晚期胃癌往往不能手术根治；而胃癌（尤其是腺癌）对放疗的敏感性较差，对化疗又容易产生耐药，故治疗难度往往大，预后也不是很理想。因此，寻找科学和可行的多种治疗途径增强放疗和化疗的疗效，从而改善预后，业已成为普通外科领域的热点研究问题。<br>　　【目的】观察survivin基因表达下调对胃癌放、化疗敏感性的影响，探讨survivin基因RNA干扰对胃癌放、化疗增敏的效果和可能的机制，为以survivin为靶基因治疗胃癌提供实验基础和理论依据。<br>　　【方法】本研究分为五个部分：<br>　　1、构建survivin基因RNA干扰载体，检测其对胃癌SGC7901细胞survivin基因表达的干扰效果。<br>　　根据RNAi设计原则，以及查得的survivin基因的编码序列，设计、合成2对survivin特异性siRNA引物（S1-1，2；S2-1，2）及1对对照引物（NC-1，NC-2），退火连接，将其分别克隆入真核表达载体pEGFP-C1，经测序鉴定无误，利用脂质体转染细胞系SGC7901（胃癌），通过G418筛选阳性克隆，利用半定量RT-PCR、Westernblot等技术从mRNA及蛋白表达水平检测survivin基因抑情况，筛选干涉效果最好的survivinsiRNA载体以及稳转细胞系进行实验研究。<br>　　2、特异性抑制survivin基因表达可提高SGC7901细胞对放、化疗的敏感性。<br>　　用MTT法绘制细胞生长曲线，平板克隆形成实验和多靶单击模型拟合细胞存活曲线以观察SGC7901细胞在不同照射剂量下对X线放射治疗敏感性的变化；MTT比色法检测2GyX线照射24h、48h和72h后细胞的生长抑制情况。顺铂、5-FU作用48小时后，用MTT比色法检测50％抑制浓度（IC50）。5ug/ml顺铂、10ug/ml5-FU作用24h、48h和72h后，用流式细胞仪检测细胞凋亡率，MTT法检测细胞生长抑制率。<br>　　3、特异性抑制survivin基因表达对胃癌裸鼠皮下移植瘤模型放、化疗的增敏作用。<br>　　直接细胞悬液接种法在裸鼠皮下建立SGC7901-S1、SGC7901-NC和SGC7901三种胃癌细胞的移植瘤模型，对比不同胃癌细胞的成瘤能力。分别用2GyX线、2mg/kg顺铂和25mg/kg5-FU对胃癌裸鼠皮下移植瘤模型进行放疗和化疗，通过测量、绘制移植瘤体积生长曲线，处死后称取移植瘤瘤重，观察抑制survivin基因表达对移植瘤放、化疗的增敏作用。<br>　　4、特异性抑制survivin基因的表达对胃癌细胞化疗增敏作用的机制研究。<br>　　5ug/ml顺铂作用24h、48h和72h后，流式细胞仪PI单染色法检测细胞周期变化，AnnexinV-FITC/PI双标记流式细胞仪检测细胞凋亡率，DNA琼脂糖凝胶电泳分析、TUNEL染色检测细胞凋亡改变。<br>　　【结果】<br>　　1．成功构建了survivinRNA干扰载体pEGFP-C1-S1、pEGFP-C1-S2和对照载体pEGFP-C1-NC；建立了3组稳定转染细胞系：SGC7901-S1、SGC7901-S2、SGC7901-NC。<br>　　2．SGC7901-S1、SGC7901-S2细胞中survivinmRNA和蛋白表达均下调，尤其以pEGFP-C1-S1的干涉效果为好，其稳定转染细胞系SGC7901-S1中mRNA和蛋白表达的抑制率分别为：58.7％和55.8％。<br>　　3．随X线放射治疗的照射剂量升高，SGC7901-S1、SGC7901-NC、SGC7901细胞的克隆形成率出现下降。同一剂量照射下，SGC7901-S1细胞的克隆形成率较其他细胞显著降低，细胞存活曲线显示：SGC7901-S1D0、Dq值显著下降，分别为：2.457、1.471，其放射增敏比（SER）分别为：1.176（D0值比）、1.347（Dq值比）；2GyX线照射后各组细胞的凋亡率和生长抑制率随着时间的延长有着明显的提高，各检测点SGC7901-S1细胞凋亡率和生长抑制率明显高于其它两组细胞。<br>　　4．随着顺铂、5-FU药物浓度升高，SGC7901-S1、SGC7901-NC、SGC7901细胞的存活率出现下降。在同一药物浓度下，SGC7901-S1细胞存活率下降更明显。MTT法测得顺铂处理72小时的IC50值为5.61±0.32ug/ml，5-FU处理72小时的IC50值为8.91±0.39ug/ml。随着时间的延长，5ug/ml顺铂或10ug/ml5-FU处理后的细胞凋亡率和生长抑制率出现增加，各检测点SGC7901-S1的细胞凋亡率和生长抑制率明显高于SGC7901-NC、SGC7901细胞。<br>　　5．成功建立3组人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，成瘤率100％。3组的平均成瘤时间分别为：SGC7901组裸鼠7.55±0.38天，SGC7901-NC组裸鼠7.38±0.48天，SGC7901-S1组裸鼠15.33±0.58天。<br>　　6．X线放疗后不同检测点接种SGC7901-S1组裸鼠肿瘤体积明显小于接种SGC7901-NC、SGC7901组，肿瘤生长明显受抑。观察结束后，接种SGC7901-S1组裸鼠瘤重明显小于接种SGC7901-NC、SGC7901组，分别为1.623±0.248g、2.725±0.332g和2.831±0.356g（P<0.05）。<br>　　7．顺铂化疗后不同检测点接种SGC7901-S1组裸鼠肿瘤体积明显小于接种SGC7901-NC、SGC7901组，肿瘤生长明显受抑。观察结束后，接种SGC7901-S1、SGC7901-NC、SGC7901组裸鼠瘤重分别为1.358±0.258g、2.782±0.371g和2.727±0.373g（P<0.05）。相似的情况也出现在5-FU化疗后，观察结束后，接种SGC7901-S1组裸鼠瘤重明显小于接种SGC7901-NC、SGC7901组，分别为1.228±0.215g、2.753±0.347g和2.801±0.382g（P<0.05）。<br>　　7.流式细胞仪检测化疗后各组细胞的细胞周期发现，SGC7901-S1组细胞出现G2/M期阻滞，细胞比例明显高于SGC7901-NC、SGC7901组。<br>　　8．AnnexinV-FITC/PI双标记检测结果显示，化疗后SGC7901-S1组的凋亡比例明显高于SGC7901-NC、SGC7901组。<br>　　9.DNA琼脂糖凝胶电泳分析SGC7901组细胞核的DNA裂解为大小约为180-200bp（及其整数倍）的寡核苷酸片断，电泳图谱呈现明显的阶梯状(DNAladder)。<br>　　10．TUNEL荧光染色法检测细胞凋亡，SGC7901-S1组阳性细胞的数量明显增加，表现为细胞核内出现强的黄绿色荧光。<br>　　【结论】<br>　　1．成功构建并筛选出干涉效果较好的survivinRNA干涉载体，并筛选出相应的人胃癌稳定转染细胞系SGC7901-s1，经检测其对survivin基因mRNA和蛋白的表达干扰效果较好。<br>　　2．体外实验证明，特异性抑制survivin基因的表达可显著增强胃癌细胞SGC7901对X线放射治疗和顺铂、5-FU化疗的敏感性。<br>　　3．成功建立3组人胃癌裸鼠皮下移植瘤模型，通过体内实验证明，特异性抑制survivin基因的表达可增强X线放射治疗和顺铂、5-FU化疗对移植瘤的生长抑制，提高移植瘤的放、化疗敏感性。<br>　　4．特异性抑制胃癌细胞survivin基因的表达后，化疗细胞出现了显著的G2/M期阻滞和凋亡现象，说明抑制survivin的表达对胃癌细胞放、化疗增敏作用的机制，可能跟survivin调控细胞周期进程、诱导凋亡的作用有关。这为今后明确survivin的调控细胞凋亡的作用及影响放化疗敏感性等通路中的可能定位和机制，提供了良好的实验基础。抑制survivin基因表达很有希望成为一种新的化疗和放疗的增敏途径，应用于临床中胃癌的治疗，以提高疗效和改善预后。