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摘要【背景】<br>　　多药耐药(MDR)通常是导致包括胃癌在内的肿瘤化疗失败最主要的原因之一。胃癌的MDR机制在本实验室和其他地方已进行了较广泛而深入的研究，尽管目前已发现一些重要的分子和信号通路，然而仍未能完全阐明MDR，提示其他分子或信号通路也可能参与了MDR的发生。<br>　　哺乳动物细胞在缺氧，内质网应激，氨基酸缺乏，以及氧化应激等应激信号影响下，真核转录起始因子2α单位(eIF2α)会被磷酸化激酶磷酸化，这一磷酸化事件则会引起迅速的和全面的蛋白生物合成减少，同时一部分基因会发生表达的上调。这些上调的基因可以减轻应激所致的细胞损伤，而其中重要的一个基因就是ATF4。在目前关于ATF4的文献中，尽管一部分研究发现ATF4在严重或过长时间应激的诱导下可发挥促凋亡作用，大量研究结果仍提示ATF4是一个重要的应激反应基因，其在调节细胞适应集合应激反应(ISR)的多种不利环境下发挥着重要的保护作用。近来，一部分研究报道ATF4在多种恶性肿瘤中高表达，并且能保护肿瘤细胞免于多种应激以及化疗药物所致的损伤。这些保护作用潜在的机制包括诱导自噬，促进DNA损伤修复，以及上调细胞内谷胱甘肽等。然而，关于ATF4在胃癌MDR中的作用尚未见相关报道。<br>　　【目的】<br>　　研究ATF4是否在胃癌MDR发生中发挥一定的作用以及其可能的分子机制。<br>　　【方法】<br>　　1.ATF4在胃癌MDR中的作用<br>　　1）用qPCR和Westernblot在胃癌亲本细胞SGC7901及其相应的多药耐药株SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中检测ATF4的mRNA和蛋白水平。2）用Addgene公司的PLKO.1-TRC病毒载体构建针对ATF4的特异性以及无关对照siRNA慢病毒，分别命名为LV-siATF4和LV-SCR；使用FUW-teto载体构建表达ATF4的慢病毒，其对照空载体慢病毒作为对照，分别命名为LV-ATF4和LV-Vector。3）通过慢病毒转染相关胃癌细胞系，并使用puromycin或zeocin进行筛选，建立相应的稳转细胞系。4）用平板克隆形成实验检测LV-ATF4和LV-Vector稳转的SGC7901和AGS细胞系，以及LV-siATF4和LV-SCR稳转的SGC7901/ADR和SGC7901/VCR细胞系在顺铂(CDDP)作用下的集落形成能力。5）用MTT实验检测LV-ATF4和LV-Vector稳转的SGC7901，以及LV-siATF4和LV-SCR稳转的SGC7901/ADR细胞在体外对不同药物的敏感性差异。6）用Hoechst33258染料核染色,DNA碎裂检测(DNAfragmentationassay)，以及用Westernblot检测剪切形式的caspase-3来检测5）中的几种稳转细胞系以及其相应的亲本细胞对CDDP诱导凋亡反应的差异。<br>　　2.ATF4对应激反应基因SIRT1的转录调控研究<br>　　7）用qPCR和Westernblot在5）中的几种稳转细胞系中检测SIRT1的mRNA和蛋白水平。8）在5）中的几种稳转细胞系以及其相应的亲本细胞中用Westernblot检测MDR1,MRP,Bcl-2和Bax的表达。9）使用生物信息学软件(Tfsitescanservice,TESS和Genomatix)分析SIRT1基因的5’端序列的转录因子结合位点。10）化学合成约1.2kb的人SIRT1基因启动子序列片段(-1100至+100bp)并将其克隆入pGL3-Basic质粒的XhoI和HindIII酶切位点之间。11）用Luciferase报告基因实验来检测ATF4对SIRT1启动子活性的影响。12）用ChIP实验检测ATF4对SIRT1启动子的直接结合能力。13）使用定点突变实验突变SIRT1启动子报告基因质粒上可能的ATF4结合位点并构建相应的点突变质粒。14）使用Luciferase报告基因实验检测潜在的ATF4结合位点突变后对ATF4激活SIRT1启动子活性的影响。<br>　　3.SIRT1在ATF4诱导胃癌MDR发生中的作用研究。<br>　　15）对LV-ATF4稳转的SGC7901和AGS细胞系分别转染SIRT1特异性或无关对照siRNA，之后用平板克隆形成实验检测在CDDP作用下的集落形成能力。16）对LV-ATF4稳转的SGC7901细胞分别转染SIRT1特异性或无关对照siRNA，之后用MTT实验检测其在体外对不同药物的敏感性差异。17）对LV-ATF4稳转的SGC7901细胞分别转染SIRT1特异性或无关对照siRNA，用流式细胞术，Hoechst33258染料核染色,以及用Westernblot检测剪切形式的caspase-3来检测其对CDDP诱导凋亡反应的差异。18）在17）中的细胞中检测MDR1,MRP,Bcl-2和Bax的表达。19）用MTT实验检测EX-527对于LV-ATF4和LV-Vector稳转的SGC7901的基础毒性。20）使用不同浓度的EX-527与LV-ATF4和LV-Vector稳转的SGC7901细胞预孵育24小时后，使用Westernblot检测SIRT1,ATF4,MDR1,MRP,Bcl-2和Bax表达变化。21）使用不同浓度的EX-527与LV-ATF4稳转的SGC7901细胞预孵育24小时后，用MTT实验检测CDDP和5-FU对以上细胞的毒性。22）用MTT实验检测EX-527和不同浓度CDDP和5-FU对LV-ATF4稳转的SGC7901细胞增殖是否具有协同抑制作用。<br>　　【结果】<br>　　1.ATF4可促进胃癌多药耐药表型的发生并且阻断ATF4表达可逆转胃癌多药耐药细胞对化疗药物的抵抗<br>　　1）ATF4的mRNA和蛋白水平在多药耐药株SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中均明显高于其亲本细胞SGC7901。2）LV-siATF4和LV-SCR，以及LV-ATF4和LV-Vector等慢病毒载体均得以成功制备。3）成功建立了LV-ATF4和LV-Vector稳转的SGC7901和AGS细胞系，以及LV-siATF4和LV-SCR稳转的SGC7901/ADR和SGC7901/VCR细胞系。4）在SGC7901和AGS细胞系过表达ATF4后使得相应细胞在CDDP作用下克隆数为空载体转染组的近三倍；而在耐药细胞株SGC7901/ADR和SGC7901/VCR中下调ATF4表达后则导致CDDP作用下克隆数较对照组减少两到三倍。5）在SGC7901中稳定转染ATF4后，阿霉素(ADR)，长春新碱(VCR)，顺铂(CDDP)和5-氟尿嘧啶(5-FU)的IC50值均较空载体转染组明显升高。而在耐药细胞株SGC7901/ADR中下调ATF4表达后，细胞对以上化疗药物的敏感性均较对照组明显增强。6）在一定浓度的CDDP孵育36小时后，用Hoechst33258染料核染色和DNAfragmentationassay检测在SGC7901-ATF4和SGC7901/ADR-SCR中并未发现明显的凋亡改变，而在SGC7901-Vector和SGC7901/ADR-siATF4细胞中发现了明显的细胞核浓缩破裂和DNALadder形成等细胞凋亡表现。不仅如此，使用Westernblot在SGC7901-Vector和SGC7901/ADR-siATF4细胞中较对照组更早地和更多地发现了剪切体形式的caspase-3的表达。<br>　　2.ATF4可转录激活应激反应基因SIRT1的表达<br>　　7）在SGC7901细胞中过表达ATF4后SIRT1的mRNA和蛋白水平均较对照组明显升高；而在SGC7901/ADR中下调ATF4表达后SIRT1的mRNA和蛋白水平均较对照组明显下降。8）ATF4表达高的细胞较相应的低表达ATF4的细胞中MDR1均相应高表达，且伴有升高的Bcl-2/Bax比率，MRP的表达无明显差异。9）使用在线生物信息学软件(Tfsitescanservice,TESS和Genomatix)分析SIRT1启动子序列以后，在-950至-600bp之间发现两处ATF4的潜在结合位点。10）成功地合成了约1.2kb的人SIRT1基因启动子序列片段(-1100至+100bp)并将其克隆入pGL3-Basic质粒的XhoI和HindIII酶切位点之间。DNA测序证实了质粒构建成功。11）Luciferase报告基因实验结果提示ATF4可以显著激活SIRT1基因启动子活性并且这种效应具有剂量依赖性的特点。12）使用ChIP实验在SGC7901-ATF4细胞中用ATF4抗体进行染色质免疫共沉淀发现SIRT1基因启动子上的两处ATF4结合位点的片段均呈现明显富集现象。13）针对1.2kbSIRT1-pGL3-Basic质粒上的ATF4潜在结合位点进行定点突变，成功构建了相应的点突变报告基因质粒。14）Luciferase报告基因实验结果提示突变任一潜在结合位点均可降低ATF4对SIRT1基因启动子活性的激活能力，同时突变两个结合位点则完全阻断了ATF4对SIRT1基因启动子活性的影响。<br>　　3.SIRT1在介导ATF4诱导的胃癌多药耐药中发挥了关键的作用<br>　　15）在SGC7901-ATF4和AGS-ATF4细胞中用特异性siRNA下调SIRT1表达后联合使用CDDP可使平板克隆形成数目较转染非特异siRNA的对照组下降40％以上。16）MTT实验结果提示用特异性siRNA下调SIRT1可使SGC7901-ATF4细胞对化疗药物的敏感性得到一定程度的恢复，而在转染非特异siRNA的对照组中未见药物敏感性的改变。17）在CDDP作用下，流式细胞术和Hoechst33258核染色检测均提示用特异性siRNA下调SIRT1表达的SGC7901-ATF4细胞的凋亡率较转染非特异siRNA的对照组明显升高。不仅如此，使用Westernblot实验在前者中早在CDDP作用12h时便观察到了剪切体形式的caspase-3的表达，而在对照组中即使CDDP处理24h后亦未观察到明显的caspase-3的剪切体出现。18）Westernblot实验在用特异性siRNA下调SIRT1表达的SGC7901-ATF4细胞中发现MDR1的表达较转染非特异siRNA的对照组明显减少，而MRP，Bcl-2和Bax的表达未见明显改变。19）MTT实验结果发现浓度高至10μM的EX-527不仅没有抑制LV-ATF4和LV-Vector稳转SGC7901细胞的活性，反而轻度促进了两种细胞数量的增长。20）使用不同浓度的EX-527与LV-ATF4和LV-Vector稳转的SGC7901细胞预孵育24小时后，Westernblot检测结果显示仅MDR1的蛋白水平出现与EX-527浓度负相关的变化，而SIRT1，ATF4，MRP，Bcl-2和Bax表达与EX-527浓度改变无明显相关。21）使用不同浓度的EX-527与LV-ATF4稳转SGC7901细胞预孵育24小时后，MTT实验结果提示EX-527可增强CDDP和5-FU对以上细胞的毒性并呈现浓度依赖性的特点。22）10μM的EX-527可有效协同不同浓度CDDP和5-FU对LV-ATF4稳转SGC7901细胞增殖的毒性作用。<br>　　【结论】<br>　　1.ATF4介导了胃癌细胞MDR表型的发生，将ATF4作为靶点为逆转胃癌MDR提供了一个新的途径。<br>　　2.ATF4通过了上调MDR1和Bcl-2/Bax比率等多种机制促进了胃癌细胞MDR表型的发生。<br>　　3.SIRT1是ATF4直接转录激活的一个靶基因。<br>　　4.在ATF4所致的胃癌细胞MDR的发生中，SIRT1参与并发挥了一定的作用。<br>　　5.除了SIRT1蛋白的表达之外，其去乙酰化酶的活性作用在ATF4所致的胃癌细胞MDR的发生中亦发挥了关键的作用，这一作用可能部分通过上调MDR1的表达所致。